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第一章 基于9个mRNA的预测Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌术后复发标志物的建立及验证目的:我们的目标是发展一个以基因表达为基础能够预计Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌术后复发的标志物,并确认其预后价值是否独立于共识分子亚型（consensus molecular subtype,CMS）和结直肠固有亚型（CRC intrinsic subtype,CRIS）。方法:通过芯片数据（GSE8671）分析,我们确认32对结直肠癌和邻近正常组织的表达差异基因。我们以这些表达差异基因作为候选基因,采用COX回归分析确定复发相关基因,并在芯片训练集（GSE39582,n=460）和芯片验证集（GSE17536,n=111）发现并验证一个以基因表达为基础的Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌标志物。在临床验证集（n=109）和临床独立集（n=100）中,我们建立并验证一个基于PCR技术的危险评分公式。我们将这个以基因表达为基础的标志物和其他临床变量（性别、年龄、肿瘤分期及辅助化疗）纳入无复发生存率和总生存率的多因素COX回归分析,并计算它们的危险比（hazard ratio,HR）及95%的可信区间（confidence interval,CI）。我们行受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析评估该标志物的预计能力并计算曲线下面积（area under curve,AUC）。结果:（1）我们在32对癌与邻近正常组织（GSE8671）中发现88个表达差异基因,变化倍数在10倍以上。（2）基于单因素COX回归分析,在芯片训练集中9个p值小于0.05的mRNA被选为候选基因,包括 KLK10、DUSP27、CXCL13、SCG2、C2orf40、MFAP4、C2CD4A、CHGA和CHGB。我们建立一个基于9个mRNA的标志物,用以区分高危组和低危组的Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌患者。（3）在芯片验证集中,高危组患者具有更低的无复发生存率（HR=2.918;95%CI,2.074-4.107;p＜0.001）和总生存率（HR=1.960;95%CI,1.406-2.732;p＜0.001）。在芯片训练集中,这个基于9个mRNA的标志物是一个独立影响无复发生存率（HR=2.799;95%CI,1.970-3.921;p＜0.001）和总生存率（HR=2.017;95%CI,1.443-2.821;p＜0.001）的因素。在芯片验证集中,我们也获得类似的结果。（4）我们在临床验证集中（n=109）建立一个基于PCR技术的危险评分公式。在临床验证集中,高危组患者具有更低的无复发生存率（HR=10.086;95%CI,3.491-29.136;p＜0.001）和总生存率（HR=7.309;95%CI,2.483-21.517;p＜0.001）。在临床验证集中,这个基于9个mRNA的标志物是一个独立影响无复发生存率（HR=8.155,95%CI,2.797-23.780;p＜0.001）和总生存率（HR=5.867,95%CI,1.962-17.540;p=0.002）的因素。基于相同的危险评分公式,我们在临床独立集中也获得类似的结果。（5）ROC曲线分析显示该标志物在芯片训练集（AUC:0.689 vs 0.604,p=0.030）,芯片验证集（AUC:0.762 vs 0.578,p=0.053）,临床验证集（AUC:0.807 vs 0.665,p=0.065）和临床独立集（AUC:0.711 vs 0.624,p=0.276）中可能趋向于较分期具有更高的预测价值。（6）亚组分析结果显示该标志物在芯片训练集（HR=2.630;95%CI,1.572-4.401;p＜0.001）,芯片验证集（HR=11.168;95%CI,2.407-51.815;p＜0.001）,临床验证集（HR=9.021;95%CI,1.006-21.986;p=0.018）和临床独立集（HR=5.985;95%CI,1.207-29.666;p=0.013）中能够较好的预计Ⅱ期结直肠癌患者的无复发生存率。我们在这两个芯片数据集和两个临床数据集的Ⅲ期结直肠癌患者中也获得类似的结果。（7）亚组分析结果显示该标志物能够有效预计CMS 1型（HR=4.741;95%CI,2.132-10.539;p＜0.001）,CMS2 型（HR=2.631;95%CI,1.510-4.582;p＜0.001）,CMS3 型（HR=6.047;95%CI,1.338-27.328;p=0.007）,CMS4 型（HR=2.746;95%CI,1.467-5.140;p=0.001）和 non-CMS 型（HR=3.014;95%CI,1.323-6.864;p=0.006）结直肠癌的无复发生存率。该标志物也能够有效预计CRIS-A型（HR=3.031;95%CI,1.620-5.669;p＜0.001）,CRIS-B 型（HR=4.071;95%CI,1.893-8.752;p＜0.001）,CRIS-C 型（HR=3.070;95%CI,1.635-5.764;p＜0.001）,CRIS-D 型（HR=3.012;95%CI,1.319-6.880;p=0.006）和 CRIS-E 型（HR=3.558;95%CI,1.658-7.636;p＜0.001）的结直肠癌的无复发生存率。（8）基因富集分析结果显示基于9个mRNA标志物的高危组患者涉及3个CMS4型相关的信号通路,低危组患者涉及10个CMS1-3型相关信号通路。结论:（1）我们发现并验证一个基于9个mRNA的标志物,可应用于Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌复发和死亡的危险分层,能够在不考虑CMS和CRIS亚型情况下应用。（2）但是应该声明的是该标志物在临床应用前应该在多中心前瞻性队列中得到证实。第二章:基于肿瘤间质中CD86/CD163的预测Ⅱ-Ⅲ期结肠癌术后复发标志物建立及验证目的:目前,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在癌症复发转移中发挥重要作用已经成为共识。在这个研究中,我们研究将间质的CD86+TAMs/CD163+TAMs（CD86/CD163）比值作为预测Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌患者术后复发的标志物。方法:该研究纳入来自两个独立医学中心的经过病理证实的Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌根治术后的研究队列,肿瘤相关巨噬细胞通过CD86和CD163免疫组织化学技术染色确定,计算肿瘤间质的CD86/CD163比值作为预后标志物。我们将肿瘤间质的CD86/CD163比值和其他临床变量（年龄、性别、肿瘤分期、原发部位、病理类型及辅助化疗）纳入无复发生存率和总生存率的多因素COX回归分析,并计算它们的危险比（hazard ratio,HR）及 95%的可信区间（confidence interval,CI）。我们行受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析评估间质的CD86/CD163比值的预计能力并计算曲线下面积（area under curve,AUC）。结果:（1）在训练队列中,间质中高CD86/CD163比值患者具有更高的无复发生存率（HR=0.193;95%CI,0.102-0.364;p＜0.001）和总生存率（HR=0.180;95%CI,0.090-0.362;p＜0.001）。在验证队列中,我们也获得类似的相关无复发生存率（HR=0.342,95%CI,0.162-0.723;p=0.003）和总生存率（HR=0.181;95%CI,0.063-0.520;p＜0.001）结果。（2）在训练队列中,间质中CD86/CD163比值是一个独立影响无复发生存率（HR=0.233;95%CI,0.123-0.443;p＜0.001）和总生存率（HR=0.224;95%CI,0.111-0.453;p＜0.001）的因素。在验证队列中,我们也获得类似的无复发生存率（HR=0.337,95%CI,0.159-0.717;p=0.005）和总生存率（HR=0.175,95%CI,0.060-0.506;p=0.001）结果。（3）ROC曲线分析显示间质中CD86/CD163比值在训练队列（AUC:0.682 vs 0.654,p=0.538）和验证队列中（AUC:0.697 vs 0.659,p=0.586）可能趋向于较分期具有更好的预测价值。（4）亚组分析结果显示间质的CD86/CD163比值在整个队列中能够有效地预计Ⅱ期结直肠癌患者的无复发生存率（HR=0.203;95%CI,0.077-0.534;p＜0.001）和总生存率（HR=0.148;95%CI,0.044-0.501;p＜0.001）。我们在 Ⅲ 期结直肠癌患者中也获得类似的结果。（5）亚组分析结果显示间质中CD86/CD163比值在整个队列中能够有效预计接受辅助化疗的结直肠癌患者的无复发生存率（HR=0.258;95%CI,0.145-0.458;p＜0.001）和总生存率（HR=0.170;95%CI,0.082-0.356;p＜0.001）。在整个队列中,我们在未接受辅助化疗的结直肠患者中也获得类似的结果。结论:（1）我们发现并验证一个基于间质中CD86/CD163比值的标志物,可应用于Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌复发和死亡的危险分层。结合肿瘤分期,有助于精准治疗的实施。（2）但是应该声明的是这个基于间质中CD86/CD163比值的标志物在临床应用前应该在多中心前瞻性队列中得到证实。第三章:联合使用基于9个mRNA的标志物和肿瘤间质中CD86/CD163比值作为预测Ⅱ-Ⅲ期结肠癌术后复发标志物的建立及验证目的:在这个研究中,我们评估联合使用基于9个mRNA的标志物和肿瘤间质中 CD86/CD163 比值（CD86/CD163 ratio,RatioCD86/CD163）作为预测 Ⅱ-Ⅲ 期结直肠癌患者术后复发的标志物。方法:我们在训练队列（n=104）建立基于9个mRNA的标志物和肿瘤间质中RatioCD86/CD163的危险评分公式,并在验证队列（n=95）中验证该联合使用的危险评分（risk score for the combined use,RScombined）公式。我们将联合使用的危险分组和其他临床变量（年龄、性别、肿瘤分期、原发部位、病理类型及辅助化疗）纳入无复发生存率和总生存率的多因素COX回归分析,并计算它们的危险比（hazard ratio,HR）及 95%的可信区间（confidence interval,CI）。我们也行受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析评估其预计能力并计算曲线下面积（area under curve,AUC）。结果:（1）在训练队列中,基于RScombined的高危组患者具有更高的无复发生存率（HR=7.098;95%CI,3.086-16.325;p＜0.001）和总生存率（HR=7.125;95%CI,2.749-18.468;p＜0.001）。在验证队列中,我们也获得类似的相关无复发生存率（HR=6.048,95%CI,2.552-14.330;p=0.003）和总生存率（HR=5.087;95%CI,2.104-12.297;p＜0.001）结果。（2）在训练队列中,RScombined是一个独立影响无复发生存率（HR=8.102;95%CI,3.354-19.571;p＜0.001）和总生存率（HR=7.067;95%CI,2.625-19.024;p＜0.001）的因素。在验证队列中,我们也获得类似的相关无复发生存率（HR=5.328,95%CI,2.209-12.852;p＜0.001）和总生存率（HR=4.218,95%CI,1.643-10.832;p＜0.001）结果。（3）ROC曲线分析显示在整个队列中联合使用具有和单独使用基于9个mRNA的标志物具有类似的预测准确性（AUC:0.796 vs 0.778,p=0.675）,联合使用较单独使用 RatioCD86/CD163 具有更高的预测准确性（AUC:0.796 vs 0.725,p＜0.001）。结论:（1）我们发展并验证联合使用基于9个mRNA的标志物和肿瘤间质中CD86/CD163比值作为新的标志物,可应用于Ⅱ-Ⅲ期结直肠癌复发和死亡的危险分层。（2）联合使用较单独使用CD86/CD163比值能够提高预测价值,但是联合使用较单独使用基于9个mRNA的预后标志不能提高预测价值。（3）但是应该声明的是这个联合使用的标志物应该得到前瞻性外部队列的验证。