论文部分内容阅读
为了预防、治疗传染性疾病和促进家畜生长,兽用四环素在规模化养殖场广泛使用,通常40%～90%的兽用四环素以家畜排泄物（尿液或粪便）方式进入土壤,土壤中残留的四环素通过富集作用对土壤质量、生物多样性及人类健康造成潜在威胁。较单一使用微生物而言,“植物-微生物”降解四环素具有效率高、适应能力强、使用范围广且不会引起二次污染等优点。因此,筛选复合菌系是“植物-微生物”降解四环素的关键策略。本研究以规模化养殖场的牛粪为材料进行四环素降解菌群“富集驯化”,在菌群驯化过程中逐渐提高四环素浓度(50 mg L-1～200 mg L-1),通过“传代培养”的方式获得高效降解四环素的稳定菌群;在四环素降解菌群中进一步筛选单一菌株构建复合菌系（MI）,探究菌系降解四环素与氮转化关系,阐释降解途径;最后,形成“多花黑麦草-复合菌系”耦合体系修复四环素污染,为兽用四环素污染提供“植物-菌系”修复方案,主要获得如下研究结果:（1）菌群降解试验表明,接种量在1.0%～3.0%对四环素降解率的影响差异不显著（P＜0.05）,碱性条件下（p H≥7）菌群的降解率大于酸性条件（p H＜6）,添加碳源（葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖）会减弱菌群降解四环素的能力;菌群对同一浓度四环素降解能力表现为0代＜5代＜10代＜20代＜30代≈40代,四环素能显著降低稳定菌群多酚氧化酶和脱氢酶活性（P＜0.05）。响应面优化发现四环素最优降解条件为:培养时间为7 d,温度30℃,p H 7.3,接种量2.39%,四环的降解效率达73.01%。（2）菌群驯化试验表明,优势微生物群落在门水平主要为Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Ascomycota（子囊菌门）;属水平为Alcaligenes、Pseudomonas和Bacillus;功能基因tet33和tet Z的相对丰度分别为1.41～10.74和0.10～6.48。代谢通路中Metabolism的相对丰度为16.7%～18.7%,Environmental Information Processing和Metabolism也呈现相似的变化趋势,为6.01%～7.45%。通过结构方程模型发现,功能微生物群落Bacillus（r=-0.0886）和Pseudomonas（r=-0.1417）的丰度显著影响四环素降解率（r=0.75,P＜0.001）,Amino acid（r=0.3094）和Carbohydrate（r=0.5729）代谢通路;与微生物群落呈正相关的功能基因主要为tet33（r=0.0988）,sul3（r=0.0874）,emr B（r=0.4501）和mef B（r=0.877）。四环素降解菌群驯化过程中功能性微生物群落由抵抗性微生物群落主导（Function dominates Resistant）,敏感性微生物群落会威胁功能微生物群落（Sensitive threatens Function）,首次阐释了功能微生物在四环素胁迫下的演替模型,这一模型被可视化为“Paper-rock-scissors-good”。（3）复合菌系构建试验表明,从菌群中筛选出的细菌（60株）和酵母（14株）对四环素的降解率分别为50.23%～62.18%和50.44%～66.35%;通过拮抗试验构建了复合菌系（Bacillus albus:Yarrowia lipolytica=1:2,V/V;MI）,当菌系接种量为3%时四环素降解率达74.02%;在温度（20℃,30℃和40℃）、p H（6,7,8和9）和浓度(50 mg?L-1,100mg?L-1和150 mg?L-1)影响下,复合菌系降解速率符合一级生物降解动力学模型（ln C=0.2047 t-0.0407;Km=0.2047,R~2=0.9914）。碱性环境有助于四环素的降解,p H对四环素降解的影响程度为碱性＞中性＞酸性。（4）菌系对四环素降解和氮转化研究表明,在硝态氮（Na NO3）添加的条件下,四环素和NO3--N被菌系同时还原;在铵态氮（NH4+-N）添加的条件下,四环素降解的前24 h主要进行NH4+-N的同化作用和四环素的降解,以菌系的同化作用为主;在四环素降解对数期,四环素降解与硝化-反硝化反应同时进行,NH4+-N从12.94mg·L-1下降到3.33 mg·L-1,NO3--N浓度从4.25 mg·L-1下降到2.72 mg·L-1。对四环素降解产物通过PCA,样本聚类和组间差异筛选,发现四环素降解发生差异性变化主要集中在第1～5 d,在第7 d以后降解产物的组成、数目和类型减少;菌系降解四环素主要经过脱甲基（-CH3）,脱羰基（-C=O-）,脱胺基（-NH2）和脱羟基（-OH）及氧化作用等过程进行。（5）“菌系-多花黑麦草”耦合体系降解四环素试验表明,100 mg L-1四环素能够使黑麦草根尖边缘、根冠区及内部出现溃烂,不能形成完整帽状覆盖根尖,但添加菌系可使根尖细胞的数量和形态得到改善,根长和芽长分别增加23.92%和21.83%;当四环素浓度为50 mg·L-1、100 mg·L-1和150 mg·L-1时,添加菌系可使黑麦草相对电导率显著降低34.34%、13.67%和11.94%（P＜0.05）,地上鲜重增加11.22%、21.60%和1.78%;当四环素浓度为150 mg·L-1时,添加菌系可使丙二醛（MDA）含量和过氧化物酶（POD）活性显著增加25.29%和12.68%（P＜0.01）,超氧化物歧化酶（SOD）显著降低了6.36%（P＜0.05）;此外,在四环素浓度为50 mg·L-1～150 mg·L-1时,“菌系-多花黑麦草”耦合不仅能够提高四环素降解率40.63%～45.74%,还使黑麦草地下、地上部分的四环素残留显著增加24.48%～42.43%及29.92%～42.40%。综上,本研究获得了四环素高效降解菌群,揭示了菌群在四环素胁迫下的演替机制;构建了复合菌系（Bacillus albus:Yarrowia lipolytica=1:2,V/V）,明晰了菌系对四环素降解与硝化-反硝化作用的关系,推测了四环素降解途径;发现“多花黑麦草-复合菌系”的耦合体系对四环素的降解率大于单独使用菌系和黑麦草,为兽用四环素污染提供了“多花黑麦草-复合菌系”的耦合修复方案。