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黄粉虫内含丰富的蛋白资源，常被称为“蛋白质的宝库”。本研究以黄粉虫为原料进行可控酶解，从水解液中分离纯化得到具有抗凝血性质的生物活性肽；合成鉴定得到的抗凝血肽并对其凝血酶活性抑制机理进行初步研究；对抗凝血肽进行修饰以增强其凝血酶抑制活性，并对该抑制机理进行初步探究。主要研究内容及结果如下：
1、酶促水解黄粉虫制备抗凝血肽工艺研究：选用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行黄粉虫幼虫最佳水解条件探究，采用Plackett-Burman设计筛选影响水解度的显著性影响因子。结果表明：①筛选得到4个具有显著性影响的因子：底物浓度、胃蛋白酶消化时间、胃蛋白酶量、和胰蛋白酶量；②使用Box-Behnken设计对其进行响应面优化，得到抗凝血活性最强的最佳水解条件为：底物浓度19.8mg/mL，胃蛋白酶消化时间1.8h，胃蛋白酶量1634U/mL，胰蛋白酶量126U/mL；并在该条件下，响应面模型预测的抗凝血活性为82.8%，验证得到抗凝血活性为80.6%，与模型预测活性相近。③相关性分析表明抗凝血活性和水解度无线性关系。
2、黄粉虫幼虫抗凝血肽的分离纯化及鉴定：将黄粉虫幼虫水解产物先后进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反向高效液相分离纯化，所得活性组分的抗凝血活性值分别为40.9%（8.0mg/mL）、65.6%（8.0mg/mL）和28.7%（0.2mg/mL）；最后通过液相色谱串联质谱法鉴定得到新的潜在具有抗凝血活性的肽，序列为SLVDAIGMGP和AGFAGDDAPR。
3、P2与凝血酶的相互作用机理初探：对鉴定得到的肽进行化学合成，证明AGFAGDDAPR（P2）具有较强的凝血酶抑制活性，其IC50值为163μM。分别通过荧光光谱、紫外可见光谱、圆二色谱、傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱研究了P2与凝血酶的相互作用。结果表明：①肽P2可能主要通过氢键与凝血酶结合，导致荧光猝灭，同时凝血酶的二级结构发生改变，β-折叠减少，无规卷曲增加；②P2与凝血酶的脯氨酸残基和赖氨酸残基结合，改变了凝血酶的空间结构；③通过Discovery studio软件对P2与凝血酶进行分子对接研究，得到最佳对接构象的“-CDOCKER ENERGY”为135.97kcal/mol。
4、RGD修饰肽与凝血酶的相互作用初探：①通过分子对接，得到“-CDOCKER ENERGY”为178.68kcal/mol的N-RGDAGFAGDDAPR的氨基酸序列的合成肽P3被期望具有较高抗凝血活性。进一步研究表明：肽P3的抗凝血活性IC50为115μM；②酶促动力学实验表明，P3是凝血酶的竞争性抑制剂，抑制系数Ki=106μM，③荧光光谱和三维荧光表明，P3或在一定程度上改变凝血酶的二级结构和某些发色氨基酸残基的微环境；④P3可能通过氢键自发地以1∶1的形式与凝血酶exosite1部位结合；⑤分子动力学模拟显示了在添加生理盐水的环境中，P3与凝血酶结合能趋于稳定态，这也意味着P3可能可以作为凝血酶的有效抑制剂。
综上所述，该研究利用可控酶解制备了黄粉虫抗凝血肽，为抗凝血药物的来源提供了新思路，也在一定程度上为黄粉虫资源的综合利用提供了有益途径。
1、酶促水解黄粉虫制备抗凝血肽工艺研究：选用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行黄粉虫幼虫最佳水解条件探究，采用Plackett-Burman设计筛选影响水解度的显著性影响因子。结果表明：①筛选得到4个具有显著性影响的因子：底物浓度、胃蛋白酶消化时间、胃蛋白酶量、和胰蛋白酶量；②使用Box-Behnken设计对其进行响应面优化，得到抗凝血活性最强的最佳水解条件为：底物浓度19.8mg/mL，胃蛋白酶消化时间1.8h，胃蛋白酶量1634U/mL，胰蛋白酶量126U/mL；并在该条件下，响应面模型预测的抗凝血活性为82.8%，验证得到抗凝血活性为80.6%，与模型预测活性相近。③相关性分析表明抗凝血活性和水解度无线性关系。
2、黄粉虫幼虫抗凝血肽的分离纯化及鉴定：将黄粉虫幼虫水解产物先后进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反向高效液相分离纯化，所得活性组分的抗凝血活性值分别为40.9%（8.0mg/mL）、65.6%（8.0mg/mL）和28.7%（0.2mg/mL）；最后通过液相色谱串联质谱法鉴定得到新的潜在具有抗凝血活性的肽，序列为SLVDAIGMGP和AGFAGDDAPR。
3、P2与凝血酶的相互作用机理初探：对鉴定得到的肽进行化学合成，证明AGFAGDDAPR（P2）具有较强的凝血酶抑制活性，其IC50值为163μM。分别通过荧光光谱、紫外可见光谱、圆二色谱、傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱研究了P2与凝血酶的相互作用。结果表明：①肽P2可能主要通过氢键与凝血酶结合，导致荧光猝灭，同时凝血酶的二级结构发生改变，β-折叠减少，无规卷曲增加；②P2与凝血酶的脯氨酸残基和赖氨酸残基结合，改变了凝血酶的空间结构；③通过Discovery studio软件对P2与凝血酶进行分子对接研究，得到最佳对接构象的“-CDOCKER ENERGY”为135.97kcal/mol。
4、RGD修饰肽与凝血酶的相互作用初探：①通过分子对接，得到“-CDOCKER ENERGY”为178.68kcal/mol的N-RGDAGFAGDDAPR的氨基酸序列的合成肽P3被期望具有较高抗凝血活性。进一步研究表明：肽P3的抗凝血活性IC50为115μM；②酶促动力学实验表明，P3是凝血酶的竞争性抑制剂，抑制系数Ki=106μM，③荧光光谱和三维荧光表明，P3或在一定程度上改变凝血酶的二级结构和某些发色氨基酸残基的微环境；④P3可能通过氢键自发地以1∶1的形式与凝血酶exosite1部位结合；⑤分子动力学模拟显示了在添加生理盐水的环境中，P3与凝血酶结合能趋于稳定态，这也意味着P3可能可以作为凝血酶的有效抑制剂。
综上所述，该研究利用可控酶解制备了黄粉虫抗凝血肽，为抗凝血药物的来源提供了新思路，也在一定程度上为黄粉虫资源的综合利用提供了有益途径。