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2017年是CAR-T元年,FDA批准两款CAR-T产品上市,分别是诺华的Kymriah和Kite制药的Yescarta。然而这些CAR-T细胞属于私人订制产品,均来源于患者自体T细胞,具有昂贵且冗长的生产过程;危重病人的T细胞存在数量及质量差的风险,且不能及时给药;有生产失败的风险;可能发生肿瘤细胞污染;用于生产CAR-T细胞的T细胞源自患者自体,无法保证产品的稳定性和质量控制,很难生产出标准化的产品,限制了大规模的临床应用。因此制备同种异体通用型CAR-T细胞是解决上述问题的一个较好的策略。目的本研究拟构建慢病毒表达载体p LVX-EF1α-CAR19,转导健康人来源的脐带血单个核细胞(cord blood mononuclear cells,CBMC),以表达靶向人CD19分子的CAR序列;同时采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过电穿孔导入RNP复合物,以敲除TCR和HLA-I类分子,从而获得靶向CD19的同种异体通用型CAR-T细胞,并在体外验证其杀伤活性。方法:第一部分:慢病毒制备及其感染人原代T细胞条件优化1.分别采用二代和三代慢病毒包装质粒,经脂质体Lipofectamine 3000介导的脂质体转染方法共转染人胚肾293FT细胞,获得重组慢病毒。比较不同慢病毒包装系统、启动子及病毒保存方法对慢病毒滴度的影响;2.采用Ficoll密度梯度离心法获得CBMC,用磁珠从CBMC中分选出CD3+T细胞,经抗CD3/CD28磁珠活化后24小时感染慢病毒。流式细胞术检测病毒感染率。观察不同磁珠用量、感染时间对病毒感染率的影响;第二部分:靶向CD19同种异体通用型CAR-T细胞的构建及体外杀伤效应1.采用PCR方法扩增CD19-CAR序列片段,通过Eco RI和Mlu I双酶切慢病毒载体质粒p LVX-EF1α-EGFP,构建p LVX-EF1α-CAR19慢病毒表达载体,并进行PCR、酶切和测序鉴定;2.将重组慢病毒表达质粒p LVX-EF1α-CAR19与p LP1、p LP2、p LP-VSVG共转染进293FT细胞,制备重组慢病毒。3.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将RNP复合物电穿孔导入T细胞,敲除T细胞上的TCR和HLA-I类基因,通过流式细胞术检测敲除效率,通过混合淋巴细胞反应验证敲除效果;采用磁珠阴性分选法获得TCR和HLA-I类基因双阴性细胞。4.用重组慢病毒感染TCR和HLA-I类基因双阴性细胞,以制备同种异体通用型CAR-T细胞;5.将同种异体通用型CAR-T细胞与CD19+恶性白血病细胞NAMALWA按照不同效/靶比(100/1,30/1,10/1)混合培养,进行杀伤实验,测定肿瘤细胞荧光素酶的表达率来计算同种异体通用型CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率;ELISA检测上清液中IL-2和IFN-γ浓度,验证同种异体通用型CAR-T细胞对CD19+恶性白血病细胞NAMALWA细胞的杀伤效果;结果:第一部分慢病毒制备及感染人原代T细胞条件优化1.比较p SPAX2,p MD2.G辅助质粒组成的二代慢病毒包装系统与p LP1,p LP2,p LP-VSVG辅助质粒组成的三代慢病毒包装系统,发现三代慢病毒包装系统病毒滴度高于二代,最终确定后续实验均选用三代慢病毒包装系统;2.EF-1α启动子的重组慢病毒表达载体包装的病毒滴度高于CMV启动子,对T细胞的感染效率也高于CMV启动子;病毒反复冻融超过两次或在4℃储存时间超过一天,滴度显著下降,从而影响病毒活性,制备的病毒至多允许在4℃储存一天和在-80℃冻融一次;3.慢病毒感染T细胞依赖于T细胞的活化;最佳感染时间点为T细胞活化后24h;第二部分靶向CD19同种异体通用型CAR-T细胞的构建和体外杀伤效应1.构建的重组慢病毒表达质粒p LVX-EF1α-CAR19经PCR、酶切、琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证构建结果正确。2.重组慢病毒表达质粒p LVX-EF1α-CAR19与三代慢病毒包装质粒包装慢病毒,感染T细胞,流式细胞仪检测结果显示CD19-CAR正确表达。3.流式细胞仪检测结果证实CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除T细胞的TCR和HLA-I类基因。混合淋巴细胞反应结果显示TCR和HLA-I类基因双缺陷T细胞具有降低的同种异体反应性并且不会引起移植物抗宿主病(graft versus host reaction,GVHD)。4.同种异体通用型CAR-T细胞显示出了强大的体外抗肿瘤活性,如溶解能力、IL-2和IFN-γ等细胞因子的分泌和增殖。结论:成功制备靶向CD19的同种异体通用型CAR-T细胞,且对CD19+恶性白血病细胞NAMALWA细胞具有强大的体外抗肿瘤活性。为进一步推进同种异体通用型CAR-T的临床前和临床转化研究奠定基础。