心肌纤维化是众多心血管疾病,如心肌梗死、冠心病、心肌病等发展至后期的共同病理改变。如何防治心肌纤维化是当前世界医学研究的难点和热点。心肌梗死后心肌纤维化(Cardiac fibrosis after myocardial infraction,CFMI)是心肌纤维化常见的临床类型之一,其核心病理环节是CFMI的主要效应细胞心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)在氧化应激、炎症因子等促纤维化因素的诱导下,出现增殖、表型分化、迁移、分泌等生物学行为的改变,导致细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)大量沉积,影响心脏舒缩功能和电信号传导,出现心力衰竭、心律失常,影响CFMI患者预后。AMPK介导的Integrin β1信号通路在CFs参与的ECM过度沉积中发挥重要作用。现代中医理论认为,CFMI属于“胸痹”、“癥瘕”等范畴,与血瘀证的病因病机密切相关。课题组前期研究发现,活血化瘀中药在调节AMPK代谢通路、优化心肌能量代谢的同时,下调CollagenⅠ、CollagenⅢ、骨桥蛋白、腱糖蛋白-C等ECM关键蛋白,抑制心肌梗死后心室重构和心功能异常。但是目前对于CFMI中ECM表达情况的研究局限于个别蛋白,活血化瘀中药在其中发挥的关键调节机制亦尚不明确。水蛭是祖国医学中经典的活血化瘀中药,具有破瘀血、通经络、消癥瘕等确切功效,以及抗凝、抗栓、抗血小板、抗心肌纤维化等药理作用。目前含水蛭中成药和水蛭素衍生物比伐芦定在抗心肌纤维化、减少心梗面积方面获得一些证据,但缺乏对水蛭素单一成分抗CFMI的疗效和机制研究。本研究采用Label-free亚蛋白质组学技术探索CFMI主要病理产物ECM的组成特点,通过建立大鼠CFMI模型和AngⅡ诱导乳鼠CFs模型,以水蛭主要有效组分水蛭素为治疗手段,从AMPK介导的Integrinβ1及其下游FAK/PI3K/Akt、TGF-β1/Smad2/3信号通路,观察水蛭素对CFMI修复过程中关键ECM蛋白表达的影响,为中医药延缓CFMI、改善心梗患者预后提供科学依据。1文献综述分别阐述CFMI的病理机制、早期识别、临床干预,突出中医药活性成分在CFMI治疗中的潜力。对传统活血化瘀中药水蛭的基源、典籍记载、成药组方、制剂开发,以及水蛭主要活性成分水蛭素治疗心血管疾病的药理学机制进行了综述,为研究水蛭素干预CFMI的实验研究奠定理论基础。2实验研究研究一心肌梗死后纤维化心肌ECM蛋白表达谱的构建与生信分析目的:通过Label-free亚蛋白质组学技术分析大鼠CFMI组织中ECM蛋白的组成特点和差异蛋白的互作机制。方法:采用结扎左冠状动脉前降支建立Wistar大鼠CFMI模型,随机分为假手术组(Sham)、模型2周组(Model 2W)、模型4周组(Model 4W),每组10 只。运用Label-free亚蛋白质组学技术分析CFMI后2周、4周大鼠心肌ECM差异蛋白改变,GO分析从细胞组分、分子功能、生物过程描述ECM差异蛋白特征,KEGG分析参与ECM差异蛋白表达的调控通路,最后通过Western Blot技术对筛选出的ECM差异蛋白进行验证。结果:共筛选出243个ECM差异蛋白。与Sham 比较,Model 2W上调显著的是骨甘氨酸(Osteoglycin),Model 2W下调显著的是巢蛋白-1(Nidogen-1),Model 4W上调显著的是光蛋白聚糖(Lumican)、胶原Ⅵ型α2链(Collagen 6A2),Model 4W 下调显著的是 Nidogen-1;与 Model 2W 比较,Nidogen-1、踝蛋白-1(Talin-1)在Model4W显著下调(P<0.05)。GO分析显示,ECM差异蛋白功能显著富集在细胞外区域、细胞外基质等细胞组分,受体结合、金属离子结合、Integrin结合等分子功能,以及免疫调节、蛋白转运、膜组织、细胞间信号转导、细胞粘附等生物过程。KEGG分析显示,黏着斑激酶(FAK)、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、Integrinβ1与ECM受体通路显著富集。Western Blot 结果显示,与 Sham 比较,Model 2W 组 Collagen 6A2、Lumican、Talin-1 表达上调,Model 4W组 Collagen 6A2、Lumican 显著升高,Nidogen-1 显著下降(P<0.05)。与 Model2W组比较,Model4W 组 Nidogen-1、Lumican、Talin-1 表达下调(P<0.05)。其中,与 Sham 比较,Model 4W 组 Collagen 6A2、Lumican 表达上调,Nidogen-1 表达下调;与 Model 2W 组比较,Model 4W组Nidogen-1、Talin-1 表达下调,Label-free 结果与 Western Blot 结果一致。结论:参与CFMI发生的ECM差异蛋白调控靶点为Collagen 6A2、Nidogen-1、Lumican、Talin-1、Osteoglycin 等,其作用机制可能涉及 FAK、PI3K/Akt、Integrinβ1等信号通路。研究二水蛭素调节ECM表达干预大鼠心梗后心肌纤维化的效应机制目的:观察水蛭素对CFMI大鼠心脏功能、血清标记物、心肌病理、分子病理的影响,探讨水蛭素干预ECM重建防治CFMI的效应机制。方法:采用结扎左冠状动脉前降支建立Wistar大鼠CFMI模型,随机分为4组:假手术组(Sham,生理盐水)、模型组(Model,生理盐水)、缬沙坦组(Valsartan,144mg·kg-1)、水蛭素组(Hirudin,270mg·kg-1),每组 20 只,每天给药 1 次,连续给药4周。心脏超声检测各组大鼠舒张末期/收缩末期的左室内径(LVD)、室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室容积(EDV/ESV)、左室射血分数(LVEF);血清学检测心肌损伤(CK-MB、cTnT)、心力衰竭(ANP、BNP)、氧化应激(Ang Ⅱ、MDA、SOD)等标记物;TTC染色、HE染色、Masson染色、天狼星红染色观察心肌梗死及纤维化病变情况;免疫组化和Western Blot技术观察ECM差异蛋白表达;Western Blot技术观察AMPK、Integrin β1、FAK、PI3K p110α PI3K p110(3、Akt、TGF-β1、Smad2/3 等信号通路蛋白表达。结果:(1)与 Sham 组比较,Model 组 IVST、LVPWT 减少,LVD、EDV、ESV增高,LVEF降低(P<0.05),提示CFMI模型建立成功。与Model组比较,Hirudin 组 IVSTs、LVPWT、LVEF 升高,LVD、EDV、ESV 降低(P<0.05)。(2)与 Model 组比较,Valsartan 组、Hirudin 组 CK-MB、cTnT、ANP、BNP、Ang Ⅱ、MDA水平显著下降,SOD显著升高(P<0.05)。(3)与Model组比较,Valsartan组、Hirudin组心重指数、心梗面积减少,胶原容积分数显著降低;Hirudin组血管周围胶原容积分数显著降低(P<0.05)。与Model组比较,Valsartan组、Hirudin 组 Collagen 6A2、Lumican 表达减少,Nidogen-1 表达增多(P<0.05)。(4)与 Model 组比较,Valsartan 组、Hirudin 组 AMPKα、FAK、PI3K p110α、Akt蛋白活性上调,Integrinβ1、TGF-β1、Smad2/3蛋白表达下调(P<0.05),PI3K p110β蛋白表达无显著变化(P>0.05)。结论:水蛭素能够改善CFMI大鼠左室扩张,提高心脏功能,减轻心肌损伤,减少心重指数、心梗面积,减轻心肌组织和血管周围胶原沉积,从而延缓CFMI进展;其机制与调节Collagen 6A2、Lumican、Nidogen-1等ECM差异蛋白代谢,调控心肌 AMPKα/Integrin β1/FAK 及其介导的下游 PI3K/Akt、TGF-β1/Smad2/3 信号通路有关。研究三水蛭素干预Ang Ⅱ诱导乳鼠心肌成纤维细胞ECM表达的机制目的:通过Ang Ⅱ诱导乳大鼠心肌成纤维细胞(NRCFs)模型,观察水蛭素对NRCFs形态、增殖、表型分化、迁移、分泌等细胞生物学行为的影响机制。方法:分离、提取、培养NRCFs,经免疫荧光鉴定波形蛋白(+)/vWF(-)后,给予不同浓度(10-9 mol·L-1、10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1)AngⅡ诱导不同时间(6h、12h、24h、48 h),采用CCK-8法观察NRCFs增殖活力,确立Ang Ⅱ诱导NRCFs促纤维化模型的适宜浓度和时间。NRCFs分为4组:对照组(Control)、模替型组(Ang Ⅱ)、缬沙坦组(Valsartan)、水蛭素组(Hirudin),给予相应药物预干预30 min后加入Ang Ⅱ诱导NRCFs。采用流式细胞法观察各组NRCFs细胞周期,α-SMA法观察NRCFs表型转化,Transwell小室试验和划痕试验观察NRCFs迁移,HYP含量测定法观察NRCFs胶原蛋白分泌,免疫荧光染色技术观察ECM差异蛋白分泌情况,Western Blot技术观察AMPKα1/α2、Integrinβ1、FAK、TGF-β1、Smad2/3、Nideogen-1 蛋白表达情况。结果:(1)NRCFs培养24h后生长良好,波形蛋白(+)/vWF(-)的NRCFs比例在(98.09±1.03)%。选定 Ang Ⅱ以10-6mol·L-1刺激24h作为诱导NRCFs纤维化改变的理想模型。(2)与Ang Ⅱ组比较,Valsartan组、Hirudin组静止期G0G1期细胞百分比增多、增殖期S期细胞百分比降低,α-SMA免疫荧光染色阳性的细胞数量、穿越Transwell小室的细胞数量减少,划痕宽度延长(P<0.05)。(3)与 Ang Ⅱ 组比较,Valsartan 组、Hirudin 组 HYP 含量降低,Lumican、Collagen 6A2荧光强度下降,Hirudin组Nidogen-1、Talin-1荧光强度升高(P<0.05)。(4)与Ang Ⅱ组比较,Valsartan组、Hirudin组AMPKα1/α2、FAK表达上调,Integrin β1 表达下调,Valsartan 组 TGF-β1、Smad2/3 表达下调(P<0.05);Hirudin组 TGF-β1、Smad2/3,Valsartan 组、Hirudin 组 Nidogen-1 表达无差异(P>0.05)。结论:水蛭素能够抑制Ang Ⅱ诱导的NRCFs增殖、表型分化、迁移、分泌等细胞生物学行为的改变,其机制与调节AMPK/Integrin β1/FAK信号通路表达,进而优化NRCFs对Ang Ⅱ诱导的促纤维化因素的处理能力有关。