【摘 要】
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阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌(Streptomyces viridoehrongenes)有氧发酵产生的一种低聚糖类抗生素,具有促生长、安全性高等特点而被广泛作用兽用饲料添加剂。目前阿维拉霉素产品只有美国礼来公司生产,导致技术垄断,国内阿维拉霉素产生菌产素能力低,还无商家对阿维拉霉素相关产品进行生产,对于阿维拉霉素高产菌种选育的研究尚处于探索阶段,因此需要一种简单、有效的阿维拉霉素产生菌的选育方法
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阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌(Streptomyces viridoehrongenes)有氧发酵产生的一种低聚糖类抗生素,具有促生长、安全性高等特点而被广泛作用兽用饲料添加剂。目前阿维拉霉素产品只有美国礼来公司生产,导致技术垄断,国内阿维拉霉素产生菌产素能力低,还无商家对阿维拉霉素相关产品进行生产,对于阿维拉霉素高产菌种选育的研究尚处于探索阶段,因此需要一种简单、有效的阿维拉霉素产生菌的选育方法。本研究主要是通过核糖体工程技术对实验室保存的绿色产色链霉菌进行改造,采用链霉素抗性突变筛选阿维拉霉素高产菌株,在同等条件下研究突变前后菌株的生长形态差异,并通过链霉素抗性所涉及的rpsL基因、菌体全蛋白和胞内代谢物水平的差异进行分析探讨,不仅为突变菌株抗生素的高产提供理论支撑,也为绿色产色链霉菌菌种选育提供一种新的思路。以实验室保存的Streptomyces viridoehrongenes gs77为出发菌株,测定菌株链霉素最小抑菌浓度(MC)为700μg/mL,在MIC值下经过6批涂布平板分离、挑单共获得223株生长良好的抗性突变菌株,平均致死率达到80%以上,药敏试纸法初筛获得53株正突变菌株,正变率高达23.7%,获得5株突变菌株阿维拉霉素产量比出发菌株提高30%以上,其中突变株S.viridoehrongenes gs77-54阿维拉霉素含量为1395.79mg/mL,相比出发菌株提高1.75倍,遗传稳定。对突变前后菌株的形态特征和rpsL基因(编码核糖体蛋白S12)分析,结果显示突变菌株的气生菌丝长直形、较为粗壮,孢子为直径约1.1μm×0.6μm的椭圆形,与出发菌株存在明显区别,rpsL基因序列分析结果发现,在该基因片段中出现点突变,第356位的G突变为A,由精氨酸突变为谷氨酰胺,rpsL基因突变所导致的氨基酸的改变能否特异性的提高阿维拉霉素产量或是其高产性能的获得是否是rsmG基因的突变所导致还有待进一研究,同时SDS-PAGE结果表明突变菌株存在多个蛋白位点上调。GC-MS研究菌株突变前后的胞内代谢物水平的差异性,结果显示高产菌株的磷酸戊糖途径、脂肪酸代谢以及部分氨基酸代谢旺盛,推测这些途径的强化可能为阿维拉霉素的合成提供了聚酮类、乙酰CoA、丙酰CoA等前提物质。
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