已经证明，血管活性物质及其受体、细胞因子及其受体和细胞信号转导分子所构成的复杂网络调节血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）的功能。近年发现，全反式维甲酸（all-transretinoicacid，ATRA）及其受体以直接或间接的方式参与VSMC生物学行为的调节。　　 Krüppel-likefactor4（KLF4）是一类具有锌指结构的转录因子，广泛参与多种细胞的生长、增殖、分化及凋亡的调节。　　 Mfn-2（亦称为增殖抑制基因，HSG）是一种线粒体融合蛋白，主要在高能量需求的组织，如骨骼肌和心肌中表达。本研究利用现代分子生物学和细胞生物学实验技术，研究KLF4在ATRA诱导mfn-2表达中的作用及作用机制，发现在VSMC中，KLF4通过直接与mfn.2启动子结合激活mfn.2表达，ATRA通过激活JNK和p38MAPK信号通路使KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4与p300结合并被其乙酰化。KLF4乙酰化后与mfn-2启动子的结合活性增强。另外，在ATRA处理的VSMC中，RARα与KLF4共同激活mfn-2启动子。　　 1.KLF4介导ATRA诱导的mfn-2表达ATRA可同时上调KLF4和mfn-2表达，但KLF4在ATRA诱导mfn-2表达中的作用尚不清楚。本部分旨在探讨KLF4是否介导ATRA诱导的mfn-2表达。实验结果如下：　　 1.1KLF4介导ATRA对mfn-2表达的诱导作用RT-PCR和Westernblot结果显示，ATRA可显著诱导KLF4和mfn-2表达，并具有明显的时效关系。其中，ATRA浓度为10μM和作用时间为24h时两者的表达变化最明显。　　 1.2KLF4直接结合到mfn-2启动子上并调节其转录为了明确KLF4是否直接激活mfn-2启动子，用mfn-2报告基因（pGL3-mfn-2-luc）和KLF4表达质粒共转染A293细胞，荧光素酶活性分析结果显示，过表达KLF4以剂量依赖的方式增加mfn-2启动子活性。　　 1.3KLF4介导ATRA诱导的线粒体成簇和线粒体去极化为了分析mfn-2表达上调对VSMC线粒体动力学的影响，分别用荧光染色和电镜观察ATRA处理和KLF4过表达所引起的线粒体形态变化。　　 以上结果表明，mfn-2是受KLF4调控的靶基因，在VSMC中，KLF4介导ATRA诱导的mfn-2表达，提示KLF4在ATRA信号通路中发挥重要作用。　　 2.KLF4对mfn-2的转录激活与ATRA诱导KLF4与p300相互作用及KLF4乙酰化相关联KLF4的转录活性受与之相互作用的辅助因子以及翻译后修饰如磷酸化、乙酰化等多种方式的影响。本部分实验探讨ATRA对KLF4磷酸化和乙酰化修饰的影响，并研究这些修饰在KLF4调节mfn-2表达中的意义。　　 2.1ATRA诱导KLF4乙酰化为了阐明ATRA促进KLF4激活mfn-2转录的分子机制，本部分实验首先检测ATRA对KLF4乙酰化的影响。实验结果表明，随着VSMC被ATRA刺激时间的延长，KLF4乙酰化水平逐渐升高。　　 2.2ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4磷酸化以及KLF4与p300的相互作用为了明确KLF4与p300相互作用是否依赖于KLF4磷酸化，我们检测ATRA对KLF4磷酸化的影响。实验结果表明，ATRA刺激VSMC0.5h，KLF4的磷酸化水平开始升高，到1h达到高峰，并维持在此水平至2h。在相同的实验条件下，JNK和p38MAPK的磷酸化水平也显著升高，但ATRA刺激不影响Akt和ERK的磷酸化水平。分别以ERK特异性抑制剂PD98059、Akt特异性抑制剂LY294002、p38MAPK特异性抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125处理VSMC，阻断ERK、Akt、p38MAPK或JNK信号通路的活化后，再以10μMATRA刺激细胞1h。　　 Westernblot结果显示，SP600125和SB203580预处理可显著抑制ATRA诱导的KLF4磷酸化，而PD98059和LY294002对KLF4磷酸化无明显影响。VSMC被KLF4磷酸化位点突变体转染后，再以10μMATRA刺激细胞1h，与对照组（转染野生型KLF4表达载体）相比，KLF4磷酸化水平明显下降，同时，KLF4与p300的结合明显减少。　　 为了阐明KLF4乙酰化是否依赖于它的磷酸化及其与p300的相互作用，用SB203580和SP600125处理VSMC或者用KLF4磷酸化位点突变体转染VSMC后检测KLF4的磷酸化水平。结果显示，这些抑制剂或KLF4磷酸化位点突变体在抑制KLF4磷酸化的同时，也使KLF4乙酰化水平显著降低。　　 报告基因分析结果显示，将KLF4磷酸化位点突变体和p300共转染A293后，KLF4激活mfn-2启动子的作用消失。另外，用SP600125和SB203580处理A293细胞或者用KLF4磷酸化位点突变体转染A293细胞，在KLF4磷酸化受到抑制后，ATRA丧失对mfn-2启动子的激活作用。　　 以上结果表明，ATRA通过诱导KLF4磷酸化促进其与p300相互作用，以及KLF4乙酰化，乙酰化型KLF4对mfn-2的转录激活作用增强。　　 3.RARα通过与KLF4相互作用促进KLF4对mfn-2启动子的激活ATRA既可通过其受体介导的信号转导途径调节转录因子的活性，也可通过调节受体与相关转录因子的相互作用而调节转录因子的转录激活作用。第二部分实验已经证实，KLF4通过JNK和p38MAPK信号途径介导ATRA对mfn-2表达的诱导作用，本部分实验进一步探讨维甲酸受体（RAR）在KLF4激活mfn-2表达中的作用。　　 3.1ATRA诱导RARα和RARβ的表达ATRA能否诱导VSMC表达RAR目前尚不清楚。为了阐明RAR在KLF4介导mfn-2基因表达中的作用，首先检查ATRA对RAR表达的影响。Westernblot和RT-PCR结果显示，ATRA以时间和剂量依赖的方式显著诱导RARα表达，轻微上调RARβ表达，对RARγ的表达没有影响。　　 3.2RARα通过与KLF4结合参与ATRA诱导KLF4乙酰化的过程因为在mfn-2启动子区不存在RAR结合元件，因此，我们推测，RAR可能通过与KLF4相互作用或通过影响KLF4修饰间接调节mfn-2的表达。我们首先用RARα拮抗剂（Ro41-5253）和RARβ拮抗剂（LE135）处理VSMC或将靶向RAR的小干扰RNA（siRNA）导入VSMC，抑制内源性RAR表达后，进一步研究RAR对KLF4修饰的影响。Westernblot结果显示，RARα和RARβ拮抗剂不影响ATRA诱导的KLF4磷酸化。用RARα-siRNA敲低RARα表达显著抑制KLF4乙酰化，敲低RARβ和RARγ对KLF4乙酰化没有影响。为了阐明RAR促进KLF4乙酰化的机制，我们检测KLF4与RAR的相互作用。免疫共沉淀分析结果证实，ATRA仅促进KLF4与RARα的结合。　　 3.3RARα促进KLF4对mfn-2启动子的激活报告基因分析结果表明，与单独过表达KLF4相比，共表达RARα和KLF4显著增强KLF4对mfn-2启动子的激活作用，共转染RARα和KLF4表达载体后，再以ATRA刺激细胞可使mfn-2启动子活性进一步升高。然而，在单独过表达RARα条件下，无论ATRA刺激与否，均不能增强mfn-2启动子活性。　　 3.4RARα与KLF4相互作用依赖于KLF4磷酸化上述实验证实，KLF4与p300相互作用依赖于KLF4磷酸化。本部分实验进一步检查KLF4磷酸化是否影响其与RARα结合。免疫共沉淀分析结果证实，用SP600125和SB203580处理VSMC或者用KLF4磷酸化位点突变体转染VSMC后，ATRA诱导的RARα与KLF4的相互作用显著降低。结果表明，RARα与KLF4相互作用依赖于KLF4的磷酸化。　　 3.5敲低RARα表达抑制KLF4与p300结合为了进一步明确RARα促进KLF4乙酰化的分子机制，将靶向RARα的小干扰RNA导入VSMC，阻断ATRA诱导的内源性RARα表达后，检查RARα对KLF4与p300相互作用的影响。免疫共沉淀分析结果显示，敲低RARα表达显著抑制KLF4与p300的结合。　　 以上结果显示ATRA通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与RARα的结合，二者的结合有利于KLF4与p300的相互作用及KLF4被p300乙酰化，乙酰化型KLF4对mfn-2启动子的激活作用显著增强。　　 结论　　 1.KLF4介导ATRA诱导的mfn-2表达是通过与mfn-2启动子区的KLF4结合位点相互作用而实现的。同时，KLF4介导ATRA对核周线粒体成簇及线粒体去极化的诱导作用。　　 2.ATRA通过激活JNK和p38MAPK信号途径而诱导KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4与p300相互作用增强并被p300乙酰化。KLF4乙酰化是ATRA激活mfn-2启动子的重要条件。　　 3.ATRA通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与RARα的结合，二者的结合有利于KLF4与p300相互作用，进而促进KLF4乙酰化及其对mfn-2启动子的激活作用。　　 4.Mfn-2是受KLF4调控的靶基因，KLF4是介导ATRA信号的重要转录调控因子。