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谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13,TGase)是一种具有多种催化功能的酶。能催化肽分子或蛋白质间发生酰基转移反应,形成共价交联而改变蛋白质的功能和特性,在食品工业等众多领域都具有十分广泛的应用。本文以茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)11019为出发菌株,分别采用接合转移方法和原生质体转化技术成功将TGase基因导入到S.mobaraensis中,实现TGase在S.mobaraensis中高效表达,主要研究结果如下:1、以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)11019为出发菌株,提取基因组DNA。根据大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pL99的序列特征,设计特异性引物,成功克隆出TGase基因。将TGase基因连接到质粒pL99中,构建过表达载体pL99-T。对TGase基因序列和TGase氨基酸序列等进行分析,TGase基因全长1224 bp,G+C含量为65.22%,A+T含量为34.78%,一共编码407个氨基酸,前26个氨基酸具有很强的疏水性,前30个氨基酸表现出较强的信号肽特征。通过对TGase三维结构同源建模分析,发现茂原链霉菌TGase主要由α-螺旋和β-折叠构成,TGase的活性中心,由催化三联体C64-D255-H274组成。2、采用酶解法制备茂原链霉菌原生质体,对原生质体的形成与再生最佳条件进行试验探索,结果如下:以茂原链霉菌二级菌丝体为种子液,接种量为10%,转接至甘氨酸含量为0.05%的YEME菌丝体培养基中,28℃,220r/min,培养至28 h,采用2.5 mg/mL溶菌酶液33℃酶解1.5 h,涂布于R2YE再生培养基,28℃培养至5 d。茂原链霉菌原生质体制备效果最佳,制备率达97.47%,再生率达13.27%。3、分别采用接合转移法和PEG介导的原生质体转化法,成功将TGase过表达载体pL99-T转化到茂原链霉菌中,结合抗性筛选和PCR验证鉴定阳性转化子。采用24孔板发酵培养和96孔板测定酶活的方法对过表达菌株进行初筛,再通过摇瓶发酵测TGase酶活进行复筛,最后筛选出高产TGase过表达SM-12,SM-12发酵液TGase酶活力高达8.68 U/mL,产酶能力比出发菌株提高了接近6倍,最后通过SDS-PAGE电泳分析,TGase在茂原链霉菌中实现高效表达。