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禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）作为一种在世界各地广泛分布的细菌性病原,不仅给养禽行业造成巨大的威胁,也给动物性食品安全防控带来严重的影响。APEC致病机理复杂,有多种致病因素参与,分泌系统作为其中之一参与APEC致病过程。VI型分泌系统（Type VI secretion systems,T6SS）作为双层跨膜分泌系统参与细菌的不同生物过程,并在其中发挥关键作用。溶血素共调节蛋白（Hemolysin-coregulated protein,Hcp）在T6SS复合体中参与组装分泌尾管,并作为效应蛋白发挥作用。Hcp蛋白功能多样,敲除hcp基因后,致病菌的运动、黏附和定植能力均会受到影响。但Hcp在APEC感染过程中与宿主细胞相互作用的调控机制尚不明确。本研究通过构建p ET-28a-hcp2重组质粒完成Hcp2蛋白的表达与纯化及多克隆抗体制备。利用纯化的一定剂量的毒力效应蛋白Hcp2处理DF-1细胞,并通过间接免疫荧光、亚细胞定位和蛋白质组学等技术研究毒力效应蛋白Hcp2是否能进入细胞及其对DF-1细胞致病作用的影响;此外,通过含有纯化Hcp2蛋白的洗脱液重悬AE17菌株气管注射雏鸡,研究Hcp2a与Hcp2b过量表达对APEC感染宿主气管黏膜上皮细胞转录组的影响,为进一步研究T6SS对APEC的致病作用提供理论依据。具体研究内容及结果如下:1.Hcp2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备本研究首先以禽致病性大肠杆菌AE17菌株的hcp2a及hcp2b基因序列设计出两对特异性引物进行PCR扩增,连接至p ET-28a载体,重组载体构建成功后转化到E.coli BL21感受态细胞。加入诱导剂IPTG诱导目的蛋白表达,并用SDS-PAGE分析蛋白表达形式。结果显示His-Hcp2a蛋白大小在23 k Da左右,在16℃、IPTG浓度为0.25 mmol/L的条件下诱导16 h表达量最高,His-Hcp2b蛋白大小在18 k Da左右,在28℃、IPTG浓度为1 mmol/L的条件下诱导12 h表达量最佳。两种蛋白均主要在上清表达。分别用His标签纯化凝胶对融合蛋白进行纯化。BCA法测定蛋白浓度并将纯化后的融合蛋白与弗氏完全佐剂等量混合作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体。间接ELISA测得Hcp2a的血清效价为1:408600;Hcp2b的血清效价为1:23400。Western Blot显示鼠源多克隆抗体与免疫原反应良好。2.Hcp2蛋白对DF-1细胞亚细胞定位的研究用一定剂量的纯化的毒力效应蛋白Hcp2处理DF-1细胞48 h,利用间接免疫荧光和亚细胞定位等技术确定毒力效应蛋白Hcp2可以成功透过DF-1细胞膜进入细胞,且Hcp2蛋白均明显定位于内质网,其中Hcp2a蛋白也定位于线粒体。而后用同等剂量的毒力效应蛋白Hcp2处理DF-1细胞48 h后进行蛋白质组学测序,结果发现,与未加毒力效应蛋白Hcp2的对照组相比,Hcp2a试验组有58差异表达蛋白,其中25个上调,33个下调。主要富集在氧化磷酸化和p53信号通路等通路。Hcp2b试验组有108差异表达蛋白,其中60个上调,48个下调。主要富集在内质网中的蛋白质加工信号通路和氧化磷酸化等通路。其中与ATP供应和蛋白质合成相关的ATP5H和THBS1蛋白均上调表达。3.Hcp2蛋白对雏鸡气管黏膜转录组的影响将含有纯化Hcp2蛋白AE17菌株经气管注射感染雏鸡并于24 h后采集雏鸡气管黏膜上皮细胞进行转录组学测序。结果显示,与野生株AE17相比,添加毒力效应蛋白Hcp2a的AE17感染组得到102个差异表达基因,其中53个基因上调表达,49个基因下调表达。添加毒力效应蛋白Hcp2b的AE17感染组得到85个差异表达基因,其中46个基因上调表达,39个基因下调表达。GO功能结果显示,添加毒力效应蛋白Hcp2a的AE17感染组的差异表达基因主要集中在氧化还原过程、氧运输、细胞质、生物膜及其膜的组成部分等GO功能条目;添加毒力效应蛋白Hcp2b的AE17感染组的差异表达基因主要集中在细胞内信号转导、免疫反应、细胞质、生物膜及其膜的组成部分等功能;KEGG分析结果显示,添加毒力效应蛋白Hcp2a的AE17感染组的差异表达基因主要富集在NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路及吞噬小体等通路;添加毒力效应蛋白Hcp2b的AE17感染组的差异表达基因主要富集在Toll-样受体信号通路、吞噬小体及细胞黏附分子（CAMs）等通路。综上所述,本研究成功构建T6SS-2毒力效应蛋白Hcp2原核表达质粒完成蛋白的表达与纯化及多克隆抗体的制备;毒力效应蛋白Hcp2能够透过细胞膜并定位于内质网,其中Hcp2a也定位于线粒体。蛋白质组学测序结果显示,Hcp2a蛋白参与氧化磷酸化信号通路,Hcp2b蛋白参与内质网中的蛋白质加工信号通路和氧化磷酸化等通路;雏鸡气管黏膜上皮细胞RNA-Seq结果显示,Hcp2a和Hcp2b蛋白主要参与Toll-样受体信号通路和吞噬小体等免疫相关通路。