高同型半胱氨酸促进GPX4甲基化介导髓核氧化/还原失衡在腰椎间盘退变中的作用机制研究

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背景椎间盘退变(IVDD)是一种由衰老、代谢、生物力学等多种因素引起的病理过程。椎间盘退变过程包括:椎间盘细胞凋亡坏死、细胞外基质降解、髓核脱水收缩、含水量降低、纤维环和终板损伤等。同型半胱氨酸(Hcy)是一种在蛋氨酸代谢、核酸生物合成、基因甲基化、神经传递和磷脂生物合成中起着关键作用的含硫氨基酸。高同型半胱氨酸血症(HHcy)表现为患者血浆同型半胱氨酸浓度升高,增加血管、神经和肌肉骨骼系统疾病的风险。同型半胱氨酸可诱导软骨细胞发生许多有害的变化,可能导致骨性关节炎(OA),包括线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧化应激积累、COX-2、IL-8和MMP-13表达增加,促进细胞外基质降解,同时降低软骨细胞介导的矿化,影响钙化软骨的性能,提示同型半胱氨酸升高可能是导致OA的危险因素。然而,作为组成椎间盘髓核、终板等结构的软骨细胞,同型半胱氨酸对其的作用研究较少,高同型半胱氨酸血症是否是椎间盘退变的危险因素,及其促进椎间盘的退变的机制亟待进一步研究。目的本研究的目的是通过临床分析研究、髓核细胞的原代细胞培养和高蛋氨酸饮食的动物模型来描述高同型半胱氨酸血症在腰椎间盘退变中的作用,探讨高同型半胱氨酸血症是否能引起GPX4甲基化,从而导致GPX4表达的抑制和氧化还原失衡,引起椎间盘退变。方法1.收集并回顾性分析椎间盘退变患者的临床资料,根据血清同型半胱氨酸浓度将志愿者分为高同型半胱氨酸组(浓度>15μmol/L)和非高同型半胱氨酸组(浓度≤15μmol/L),比较两组的椎间盘退变Pfirrmann评分分布差异。同时比较“非椎间盘严重退变”(Pfirrmann分级≤3)和“严重椎间盘退变组”(Pfirrmann分级>3)的血清同型半胱氨酸浓度值差异,明确高同型半胱氨酸血症是椎间盘退变的独立危险因素。2.体外使用不同浓度的同型半胱氨酸刺激髓核细胞,以IL-1β(10ng/ml)为阳性对照,观察不同浓度的同型半胱氨酸溶液处理对髓核细胞的合成、分解代谢的影响。通过髓核细胞内活性氧ROS和线粒体Mito SOX荧光染色检测,分析髓核细胞功能状态和氧化应激情况。检测与氧化还原反应密切相关的GPX4的表达情况及其下调机制,并使用叶酸对同型半胱氨酸促髓核细胞退变进行挽救。3.通过高蛋氨酸饮食构建小鼠高同型半胱氨酸血症模型,并构建椎间盘细针穿刺退变模型,观察其是否能加速促进椎间盘退变,并通过叶酸补充来进行挽救,明确同型半胱氨酸这个代谢因素对椎间盘退变的作用机制。结果1.高同型半胱氨酸血症促椎间盘退变危险因素的临床调查根据严重退变和非严重退变进行分组,非严重退变组血清同型半胱氨酸浓度为13.21±5.53μM,严重退变组血清同型半胱氨酸浓度为15.44±7.13μM,t检验显示两者也具有显著差异。采用二元logistics回归分析,逐步调整年龄、身高、体重等危险因素后,证实高浓度同型半胱氨酸是椎间盘退变的独立危险因素。同时在高同型半胱氨酸组中,高退变等级的椎间盘占比率较非高同型半胱氨酸组高,卡方检验两者具有统计差异。2.高同型半胱氨酸介导GPX4甲基化促进椎间盘氧化还原失衡机制研究高同型半胱氨酸刺激后髓核细胞合成代谢减弱,分解代谢增强,并存在剂量依赖性。高同型半胱氨酸刺激可引起髓核细胞氧化应激增强,导致氧化还原失衡,在这个过程中,细胞内GPX4蛋白表达量逐渐下降,髓核细胞脂质过氧化过程被上调。使用抑制剂Ferrostatin-1能够挽救高同型半胱氨酸促进的椎间盘退变。当高同型半胱氨酸刺激时,甲基化酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达量显著升高,同时可被叶酸抑制。甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐特异性PCR(BSP)测序结果显示,高同型半胱氨酸处理增加了髓核细胞中GPX4基因的甲基化,抑制GPX4基因表达。叶酸处理则可减少GPX4甲基化水平的增加,减轻髓核细胞氧化应激,抑制其脂质过氧化,挽救椎间盘退变。3.高同型半胱氨酸血症介导椎间盘脂质过氧化促进退变的体内研究相较于正常饮食组,高蛋氨酸饮食组穿刺节段椎间盘退变显著,主要表现为椎间盘高度降低、终板退变不规则和针刺节段终板硬化等,组织学显示椎间盘蛋白多糖含量降低,成骨能力增强,Col2a1阳性细胞少于正常饮食组,合成代谢减弱,而MMP13阳性细胞上调,分解代谢增强,提示高同型半胱氨酸血症加速椎间盘针刺退变。同时椎间盘内GPX4阳性细胞数下调,象征氧化反应的绿色荧光增强,还原反应的红色荧光减弱,提示脂质过氧化增强。而高蛋氨酸饮食+叶酸挽救组椎间盘退变情况较高蛋氨酸饮食组影像学和组织学相应改变轻微,脂质过氧化减轻,提示叶酸的挽救作用。结论1.通过分析磁共振退变分级与血清同型半胱氨酸水平之间的相关性,并通过进一步分析椎间盘退变患者危险因素,明确了同型半胱氨酸是椎间盘退变的危险因素,高浓度和正常浓度组两者椎间盘退变等级占比也存在差异。2.高同型半胱氨酸通过促进GPX4甲基化而上调髓核细胞的氧化应激和脂质过氧化,促进椎间盘退变,叶酸可抑制高同型半胱氨酸引起的GPX4甲基化,减轻髓核细胞氧化应激和脂质过氧化,挽救髓核细胞的变性。3.体内动物实验证实高同型半胱氨酸血症可以抑制椎间盘合成代谢,促进分解代谢,增加脂质过氧化,加速针刺促进的椎间盘退变;叶酸可抑制该过程,挽救其加速针刺椎间盘退变的过程。4.综上,高蛋氨酸饮食造成高同型半胱氨酸血症,促进甲基化酶表达,引起GPX4基因启动子甲基化,表达受到抑制,导致椎间盘氧化应激和脂质过氧化增强,最后造成椎间盘退变。叶酸通过促进同型半胱氨酸向蛋氨酸代谢,降低同型半胱氨酸浓度,挽救氧化应激和脂质过氧化,减轻椎间盘退变。
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