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番鸭呼肠孤病毒感染是由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)引起的一种免疫抑制性疾病,导致大批雏番鸭死亡,耐过的番鸭则生长停滞,给番鸭养殖行业造成巨大的经济损失。MDRV和鸡源呼肠孤病毒(Chicken reovirus,CRV)同属于禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus,ARV),但二者编码的蛋白存在一定的差异。已有报道以S1133株为代表的CRV通过小窝蛋白-1介导和动力蛋白-2依赖的内吞途径进入细胞,而对于MDRV进入细胞的内吞途径目前还没有被研究,故本试验通过荧光标记技术和利用化学抑制剂等方法探究番鸭呼肠孤病毒入侵细胞的内吞途径。试验结果如下:1.抑制剂对细胞增殖-毒性检测为保证细胞在药物处理后生长状态无明显改变,使用CCK-8试剂盒检测CPZ、M-β-CD和Dynasore三种药物合适的安全浓度。在铺满DF-1/Vero细胞的96孔板中,加入不同浓度的M-β-CD、CPZ和Dynasore,使用Cell Counting Kit-8试剂盒测定药物处理后的细胞活性,结合显微镜下观察DF-1/Vero细胞的形态学变化,最后确定以M-β-CD 0.8 mM、1.6 mM、3.2 mM;CPZ 4 μM、8 μM、16 μM;Dynasore 15.5nM、31nM、62nM等浓度作为后期试验处理DF-1/Vero细胞的药物安全浓度。2.番鸭呼肠孤病毒入侵DF-1/Vero细胞的内吞途径的初步探究CPZ和M-β-CD分别可以阻滞网格蛋白和非网格蛋白介导的内吞途径,Dynasore则是可以抑制发动蛋白-2的装配。本试验通过设置CPZ、M-β-CD、Dynasore、CPZ + M-β-CD、CPZ + Dynasore、M-β-CD+ Dynasore等不同药物分组处理DF-1/Vero细胞,而后进行MDRV感染试验,同时做好对应的阴性对照组和阳性对照组,24 h后收样。通过Real-time RT-PCR和Westren-Blot方法分别测定细胞内番鸭呼肠孤病毒p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量。结果显示:(1)使用M-β-CD0.8mM、1.6mM、3.2mM等药物浓度预处理DF-1/Vero细胞30 min后,感染]MDRV,同时设置对应的阴性对照组和阳性对照组。处理结果显示:在DF-1/Vero细胞中,相对于阳性对照组而言,随着M-β-CD药物浓度的增加,在细胞内MDRV的p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量有显著的下降趋势。这说明病毒在细胞内的复制量与M-β-CD浓度呈负相关。(2)使用 CPZ 4 μM、8 μM、16 μnM 预处理 DF-1/Vero 细胞 30 min后,感染MDRV,同时设置对应的阴性对照组和阳性对照组。处理结果显示:在DF-1/Vero细胞中,相对于阳性对照组,虽然不同浓度的药物浓度都使细胞内病毒的p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量下降,但是细胞内的病毒量不随药物浓度的不同而有所不同,说明细胞内的病毒复制量与药物浓度无明显的相关性。(3)使用 Dynasore 15.5 nM、31 nM、62 nM 预处理 DF-1/Vero 细胞30min后,感染MDRV同时,设置对应的阴性对照组和阳性对照组。处理结果显示:与在DF-1/Vero细胞中,在使用Dynasore后,用药组的细胞内病毒的p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量比阳性对照组呈显著性下降,且不同浓度的药物之间,细胞内病毒的p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量也相差显著。这说明病毒在细胞内的复制受到Dynasore的影响。(4)在DF-1细胞中,药物预处理组与只感染病毒的阳性对照组相比,使用M-β-CD和Dynasore两个药物处理后,细胞内病毒p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量随着药物浓度的增加显著性下降;而CPZ预处理后对MDRV入侵细胞没有明显影响;在加入M-β-CD和Dynasore的CPZ + M-β-CD和CPZ + Dynasore两个试验组中,细胞内的病毒量也呈显著性下降;在M-β-CD + Dynasore组中,细胞内的病毒量则为极显著性下降;在Vero细胞亦可以得到相同结果,这说明了病毒入侵DF-1/Vero细胞需要小窝蛋白和发动蛋白的参与。(5)通过免疫荧光标记MDRVσA蛋白和小窝蛋白-1,结果显示:随着时间的增加,病毒由膜外逐渐被转移至细胞核周围,以及少部分病毒则进入到细胞核内。综上所述:MDRV通过小窝蛋白介导的内吞途径侵入DF-1/Vero细胞。3.初步探究细胞骨架对番鸭呼肠孤病毒入胞的影响通过使用不同浓度的微管抑制剂Nocodazole和微丝抑制剂Cytochalasin D来预处理细胞后感染MDRV,同时设置阴性对照组和阳性对照组,24 h后收集细胞,通过Real-time RT-PCR和Westren-Blot方法分别测定细胞内病毒p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量。结果显示病毒量随着Nocodazole浓度呈依赖性递减,说明微管也参与到病毒的入胞途径中。4.番鸭呼肠孤病毒在细胞内释放环境的初步探究在内吞小体中,病毒必须通过调节内吞体的pH值以激活病毒构象改变,否则会被呈递到溶酶体中降解。目前已知CRV在内吞体中需要低pH环境,但同属与禽正呼肠孤病毒的MDRV在细胞内释放pH环境尚不明确。已知NH4C1可以调节细胞内溶酶体的pH值,本试验通过使用不同浓度的NH4C1预处理细胞以在不同程度上改变内吞小体的酸性环境,随后感染MDRV,同时设置阴性对照组和阳性对照组,24 h后收样。分别检测细胞内病毒量的变化,来确认内吞体内pH值变化对病毒释放的影响。结果显示,随着药物浓度的增加,细胞内病毒p10.8基因拷贝数和σA蛋白表达量明显受到抑制,可推测MDRV需要在低pH值的环境下,促进病毒穿透细胞质膜并完成脱壳。结论:番鸭呼肠孤病毒通过小窝蛋白介导的且需要发动蛋白参与的内吞途径进入细胞,并在内体酸性环境中,完成病毒的脱壳和复制。