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干扰素γ(interferon-gamma,IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节作用的多效性细胞因子。近年来,越来越多的研究表明IFN-γ在炎症、动脉粥样硬化、肿瘤的发生发展中起双重作用,例如IFN-γ能够促进肿瘤发生和血管生成导致肿瘤免疫逃逸。特定情况下,有效抑制IFN-γ的活性可能为某些疾病提供新的治疗思路。有研究表明肝素可以有效抑制IFN-γ的活性,成为IFN-γ活性抑制剂的潜在分子。细胞表面广泛分布的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)以其高度硫酸化的区域和IFN-γ结构中特定的碱性氨基酸残基产生静电相互作用,把IFN-γ聚集到细胞表面,从而促进HS-IFN-γ-受体三元复合物的形成,增加IFN-γ信号转导的有效性。肝素同样可以与细胞外基质中的IFN-γ相互作用,阻断上述过程进而抑制IFN-γ的活性,但是这种抑制作用的强弱与肝素精细结构的微观不均一性有很强的相关性,因此,研究两者相互作用的构效关系是全面了解这种抑制作用机制的基础。目前两者相互作用的研究进展都集中于IFN-γ方面,缺乏肝素糖链精细结构对两者相互作用影响的分子机制研究。从分子水平研究肝素寡糖与IFN-γ相互作用的构效关系,可以为合成结构明确的肝素寡糖,针对性地控制肝素对IFN-γ某些活性的抑制提供理论基础。这不仅为炎症、自身免疫疾病、同种异体移植排斥以及癌症等相关疾病提供了新的治疗策略,还可以发掘经典抗凝血剂—肝素的其他潜在治疗效果。本课题旨在研究肝素结构的差异性(糖链聚合度、硫酸化程度及硫酸化位点的不同)对于肝素和IFN-γ相互作用的影响程度,从分子水平研究肝素寡糖与IFN-γ相互作用的构效关系,为开发相关抑制剂提供理论基础。首次联合应用凝胶迁移率变动分析法(gel mobility shift assay,GMSA)、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)以及分子动力学(molecular dynamics,MD)从分子水平揭示肝素糖链精细结构在其与IFN-γ相互作用过程中的影响。通过酶解法制备了肝素寡糖,利用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)、强阴离子交换色谱(strong anion exchange-high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)以及 G10 脱盐一系列分离纯化步骤,得到三种肝素四糖和四种肝素六糖,并且通过核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)和质谱(mass spectrum,MS)对其结构进行了表征。通过GMSA法初步分析了不同肝素寡糖与IFN-γ相互作用的差异性,并确定了肝素寡糖与IFN-γ的相互作用及结合比例;通过ITC法确定了不同链长、硫酸化程度的肝素寡糖与IFN-γ相互作用的亲和度差异,对比几种肝素寡糖的结构差异,判断出当糖链聚合度相同时,还原末端GlcNS6S的6S位最为重要,末端IdoA2S的2S基团会进一步增强6S的结合能力;当糖链聚合度增加时,中间增加的二糖单元中GlcNS6S的6S仍然是增强结合能力的关键基团;在与C-IFN-γ相互作用过程中肝素硫酸化位点的重要性要大于硫酸化程度;单纯的增加糖链聚合度也并不一定会增强结合作用。通过分子对接(molecular docking,MD)计算模拟了两者之间的结合,更加直观的阐述了两者之间的相互作用关系,进一步验证GlcNS6S在肝素与IFN-γ相互作用过程中的重要作用。