放射性肺损伤(radiation-induced lung injury, RILI)是胸部肿瘤放疗的常见并发症,严重影响了患者的疗效和生存质量,临床上表现为早期放射性肺炎和晚期不可逆性放射性肺纤维化,目前相关学说尚不能完全阐明其发病机理。Thl/Th2免疫系统紊乱与肿瘤微环境及放射损伤相关。Toll样受体9(Toll-like receptor 9, TLR9)激动剂CpG-ODN具有较强的免疫调节作用,能够有效抑制Th2免疫反应,常用于气道高反应性疾病的临床及基础研究。此外CpG-ODN同时具有一定的抗肿瘤作用,目前已相继开展Ⅰ-Ⅲ临床试验。近年报道显示CpG-ODN可联合放疗有效抑制肺癌肿瘤生长,但对于CpG-ODN如何影响肺癌放疗常见并发症RILI转归尚不清楚。本课题通过构建荷瘤与无瘤小鼠RILI模型,观察不同时间点各组肺组织中Th1/Th2免疫相关因子表达情况,了解荷瘤小鼠RILI Thl/Th2免疫状态,探讨肿瘤体质和正常体质下RILI发生发展的不同规律,以明确肿瘤模式下Thl/Th2免疫对RILI的影响；同时研究CpG-ODN对不同免疫状态下小鼠RILI中肺纤维化形成的影响,并探讨其可能的免疫调节机制,为将维持免疫平衡作为防治RILI的新方法提供理论基础,并为将来更安全有效的开展放射治疗联合免疫治疗提出新思路。本研究主要包括以下三个部分第一部分：肿瘤体质对X线放射后小鼠肺组织Th1/Th2免疫平衡的影响目的：建立肺癌荷瘤小鼠模型,了解荷瘤小鼠放射性肺损伤Th1/Th2免疫状态,探讨肿瘤体质和正常体质下放射性肺损伤发生发展的不同规律。方法：选取18-25g的C57BL/6雌性小鼠,在右腋窝皮下种植Lewis肺癌细胞株,肿瘤长至直径为0.5-1.0cm时和无肿瘤小鼠随机进入实验组。用6MV X射线、单次12Gy照射全肺及肿瘤,照射后不同时间点记录肿瘤大小和体重并处死小鼠,留取相应时间点小鼠肺组织及血清。通过HE染色、Masson染色及羟脯氨酸含量检测来评估肺癌肿瘤免疫下,荷瘤小鼠及无瘤小鼠组放疗后早期肺组织炎症和纤维化程度改变。通过RT-PCR、Western blot、BDTMBA多细胞因子检测技术等技术分析荷瘤及无瘤小鼠放疗后肺组织中Th1/Th2转录因子T-bet、 GATA-3的基因和蛋白表达水平以及血清中相关细胞因子IFN-γ, IL-13表达情况。结果：放疗3周后解剖肺组织HE染色可见肺内少量癌细胞浸润,终止观测时间点到3周。观测时间点内,肺组织HE染色(200×)可见荷瘤小鼠照射组炎性充血不明显；主要以间质增厚,肺泡正常结果消失为主；无瘤小鼠照射组间质充血及炎性细胞聚集,第3天明显,且持续时间久。Masson染色(200×)结果显示两组放疗后早期均有胶原沉积,且随时间推移不断增多,荷瘤小鼠照射组胶原沉积程度明显大于无瘤小鼠照射组。荷瘤小鼠照射组羟脯胺酸含量明显高于无瘤小鼠照射组(P<0.05)。实时定量PCR结果显示,荷瘤小鼠照射组Th2转录因子GATA-3基因表达水平在放疗后各时间点表达均较无瘤小鼠照射组要高,且在1周后迅速上升；荷瘤小鼠照射组Thl转录因子T-bet基因表达在放疗后早期(第1天)达到高峰后迅速下降,而无瘤小鼠照射组早期高反应后,2周后仍见升高趋势。Western blot结果与实时定量PCR结果相似,两组Th2转录因子GATA-3蛋白表达随时间的推移逐渐增加,各时间点荷瘤小鼠照射组Th2转录因子GATA-3蛋白表达均较无瘤小鼠照射组高；荷瘤小鼠照射组Thl转录因子T-bet蛋白表达随放疗时间呈现下降趋势,3周时表达量最低,而无瘤小鼠照射组3周内T-bet随放疗时间仍呈现上升趋势。BDTMBA多细胞因子检测结果显示荷瘤小鼠照射组血清中Th2细胞因子IL-13蛋白含量随放疗后时间缓慢升高,在3周时达到高峰。除第3天表达高外,荷瘤小鼠照射组Thl细胞因子INF-y蛋白表达水平均较无瘤小鼠放射组低。结论：肿瘤体质下,小鼠较无瘤小鼠放射性肺纤维化发生时间提前且更严重,荷瘤小鼠放射性肺损伤模型同样存在Th1/Th2免疫失衡,但较无瘤小鼠放射性肺损伤模型更偏向于Th2反应,更趋向于肺纤维化。这可能作为临床肿瘤患者出现放射性肺损伤肺纤维化不可逆现象的部分解释。血清Th1/Th2细胞因子INF-γ, IL-13可以预测放射性肺损伤的程度。第二部分：免疫调节剂CpG-ODN对肺癌小鼠放射性肺损伤转归的影响目的：利用CpG-ODN免疫调节的特征,研究其对肿瘤体质下小鼠肺纤维化形成的影响。方法：引入CpG-ODN干预治疗组(CRT组),于放疗前1周及放疗后3周连续间断给药,对CpG-ODN干预治疗的安全有效性进行评估(抑瘤作用,机体Th1/Th2免疫状态干预效果),BDTMBA多细胞因子检测血清中Th1/Th2相关细胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-5、IL-13等)表达改变情况。采取第一部分方法评估CpG-ODN对荷瘤小鼠放疗后早期肺组织炎症和纤维化程度的影响。Western blot及ELISA检测辅助T细胞激活途径的主要胞内信号分子p-STAT1, P-STAT4, pSTAT6及核转录因子T-bet/GATA-3蛋白表达情况。结果：从肿瘤生长曲线发现,同样接受胸部X线照射后,CpG-ODN干预治疗组(CRT组)荷瘤小鼠肿瘤较未干预的荷瘤小鼠(LRT组)生长缓慢。 BDTMBA多细胞因子检测结果显示CRT组荷瘤小鼠血清中Thl型细胞因子IL-12和IFN-γ表达在给药后迅速增加,而Th2型细胞因子IL-5和IL-13表达减少。纤维化评分显示给予CpG-ODN干预治疗后荷瘤小鼠肺纤维化程度减轻,放疗后第14天和21天与LRT组相比减轻,具有一定统计学意义。羟脯氨酸检测结果显示各观察时间点下CRT组的胶原沉积含量较LRT组低,P<0.05。RT-PCR和WB试验结果表明LRT组肺组织中T-bet蛋白的表达明显低于CRT组,灰度值分析显示7d,14d,21d两者差异具有统计学意义(P<0.05), CRT组肺组织GATA-3蛋白的表达明显低于LRT组,灰度值分析显示7d,14d,21d两者差异具有统计学意义(P<0.05)。用双抗体夹心ELISA法分析pSTAT-1蛋白的表达可以看到,整体上看二组pSTAT-1在d7和d21天表达随时间有小幅度的下降。但各个时间点组间比较来看,给予CpG-ODN干预治疗的瘤小鼠放疗组(CRT组)在7d和21dpSTAT-1的蛋白表达均较瘤小鼠单纯放疗组高(RT组),且对比两组表达差异具有统计学意义(P<0.05)。LRT组pSTAT-4在d7和d21天表达随时间有小幅度的下降,但CRT组呈现上升趋势。从各个时间点组间比较来看,CRT组在21d的pSTAT-4蛋白表达较RT组高,对比两组表达差异具有统计学意义(P<0.05)。pSTAT-6在d7和d21天表达随时间有一定幅度上升。各个时间点组间比较来看,CRT组在21d pSTAT-6的蛋白表达低于瘤小鼠RT组,对比两组表达差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：CpG-ODN能减轻小鼠照射后肺部的炎症反应以及肺纤维化程度,并能减少肺损伤小鼠血清中Th2型炎性因子的表达,最终减轻放射性肺纤维化的发生。第三部分：TLR9激动剂CpG-ODN免疫调节小鼠早期放射肺损伤的分子机制探讨目的：研究CpG-ODN对放射性肺损伤中肺纤维化形成的影响,并探讨其可能的免疫调节机制。方法：C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为(1)RT组：12Gy X线单次照射全胸部；(2)CpG组：仅腹腔注射0.5ml CpG-ODN,每周一次,连续4周。(3) RT+CpG组：单次胸部放疗后随即给予CpG-ODN腹腔注射,方案同前。(4)CTL组：空白对照。3月后处死小鼠,留取肺组织及血液标本。病理染色评估放疗后肺组织纤维化程度；羟脯酸检测胶原沉积情况；免疫组化检测巨噬细胞,巨噬细胞M1/M2亚群分布改变,同时构建巨噬细胞模型,检测放射线照射后巨噬细胞增殖分化情况,以及免疫组化检测肺组织中纤维化分子TGF-p’情况。多细胞因子检测技术分析血清中Ⅰ/Ⅱ型细胞因子表达情况。ELISA及Western blot检测TLR9, MyD88辅助T细胞激活途径JAK-STAT通路的上下游主要胞内信号分子p-STAT1, p-STAT4, pSTAT6, JAK, SOCS3蛋白表达情况。结果：RT+CpG组小鼠肺纤维化程度明显较RT组低。RT组纤维化指数评分为5.2±0.7,而RT+CpG组纤维化指数评分为3.4±0.7,二者比较有统计学差异。其他两组肺纤维化均不明显,纤维化指数评分在0-1之间。胶原沉积情况及纤维化分子TGF-β的表达在RT+CpG组也同样呈现低水平状态,P<0.05。与CTL组相比,其他三组小鼠肺内巨噬细胞累积,平均光密度分析提示RT组巨噬细胞主要以M2亚型为主,而RT+CpG组主要以M1亚型为主,P<0.05。CpG组M1型巨噬细胞略高于CTL空白对照组。RT组血清Ⅱ型细胞因子IL-4, IL-13的表达水平较Th1型细胞因子INF-γ, IL-12高。给予CpG-ODN治疗后Ⅱ细胞因子显著下降。RT组P-STAT6表达显著高于CTL组,P<0.05,而p-STAT1, P-STAT4表达较低；CpG+RT组与RT组相反, TLR9, JAK蛋白表达水平升高明显,P-STAT6, SCOS3表达下降,P<0.05。结论：CpG-ODN逆转Th1/Th2免疫失衡从而缓解放射性肺损伤的机制之一是提高肺组织TLR9的表达,通过激活JAK-STAT1信号通路,增强Thl型免疫反应,促进巨噬细胞增殖分化成M1型巨噬细胞,释放Ⅰ型细胞因子。