缺血性脑卒中最常见的高致残致死率的疾病之一,积极预防和治疗缺血性脑卒中,降低致残率和死亡率具有重大的社会意义。目前,唯一被证实能缩小脑梗死面积、减轻神经损伤的治疗药物是重组组织型纤溶酶原激活物的溶栓治疗,但由于其严格时间窗限制,导致临床应用受到极大限制。且即使接受有效的溶栓治疗,仍有很多患者遗留下严重的神经功能缺陷。随着干细胞组织工程的发展,干细胞移植治疗给缺血性脑卒中患者的治疗和功能恢复带来了希望。由于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易获取、易扩增、不存在伦理问题以及免疫原性低等优势,被认为是干细胞移植治疗缺血性脑卒中最有优势的种子细胞。许多体内体外研究均证实,移植的BMSCs能够迁移到缺血性损伤灶周围,从而发挥损伤细胞替代、神经保护、血管再生、免疫调节等治疗功效。星形胶质细胞是神经细胞中含量最多的一种支持细胞,它具有维持谷氨酸代谢平衡,维持水代谢平衡,免疫调节,脑血管屏障的组成和维持,神经营养因子的分泌等多种功能,是保证正常神经血管单元结构和脑神经元正常电生理活动的重要支持细胞。缺血性脑卒中后,星形胶质细胞最先受创,损伤灶的星形胶质细胞多数发生凋亡,凋亡后导致细胞正常生理功能受损,大量炎性因子释放,将进一步引起级联反应,引发神经功能紊乱。未发生凋亡的细胞出现反应性增生,导致胶质瘢痕形成,过度活化释放谷氨酸、NO和炎性因子,神经元内外离子平衡紊乱,分泌神经营养因子等。因此,关于星形胶质细胞在缺血性脑卒中相关作用的的研究具有重要意义。尽管,越来越多研究者从事BMSCs移植治疗缺血性脑卒中相关机制的探讨,并已有相关证据证实BMSCs可通过结构整合、免疫调节和细胞旁分泌等方面发挥疗效。但尚少有从"BMSCs旁分泌与星形胶质细胞活性和功能关系”的角度来揭示这种治疗机制,本课题以此为关注焦点进行实验研究,旨在进一步完善BMSCs移植治疗缺血性脑卒中疗效机制的证据。研究表明,移植后的BMSCs通过分泌各种旁分泌因子(包括细胞因子、趋化因子和营养因子等)与损伤灶周围的各种脑实质细胞相互影响,发挥抗凋亡、免疫调节、血管再生、化学趋向、抗胶质瘢痕形成、神经营养、神经干细胞的诱导分化等旁分泌作用。本课题分别以大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)和氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型为基础,首先在大鼠MCAO模型急性期,给予局灶注射BMSCs及其上清液(bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium,BMSC-CM,含旁分泌因子),干预7d后,观察比较脑梗塞面积和神经功能恢复情况,并检测了神经组织细胞凋亡以及星形胶质细胞反应性增生。结果表明,注射的BMSC-CM与BMSCs相似均能够产生治疗作用,均能抑制局灶星形胶质细胞的凋亡和反应性增生。上述实验间接提示了BMSCs能够通过分泌旁分泌因子保护缺血性脑卒中后引起的损伤,并能够抑制星形胶质细胞的凋亡和反应性增生。为进一步研究BMSCs旁分泌因子对缺血性脑卒中后星形胶质细胞活性和反应性增生影响的具体机制,本课题在体外OGD模型的基础上,对损伤后的星形胶质细胞应用BMSC-CM或采用Transwell共培养系统与BMSCs共培养进行干预(再灌注),以损伤星形胶质细胞的存活和反应性增生情况为检测指标,并研究p38 MAPK和JNK,以及其下游通路p53和STAT1在旁分泌因子对损伤星形胶质细胞影响的中发挥的作用。结果表明,旁分泌因子通过抑制p38 MAPK和JNK信号通路,进而保护OGD/再灌注后损伤的星形胶质细胞,减少细胞凋亡并抑制GFAP的过表达,且p38 MAPK和JNK信号通路的下游分子p53与STAT1也参与了该过程。另外,缺血性脑卒中后引起的星形胶质细胞氧化应激、炎症因子释放、神经营养因子分泌紊乱、谷氨酸／水代谢失衡以及细胞兴奋毒性等内环境的紊乱,进一步加重了神经细胞的损伤和神经功能的紊乱。本课题在体外OGD模型的基础上,对损伤后的星形胶质细胞应用BMSC-CM或采用Transwell共培养系统与BMSCs共培养进行干预(再灌注),观察了损伤星形胶质细胞的ROS产生,炎症因子、神经营养因子、水通道蛋白以及谷氨酸转运体mRNA表达的情况。结果发现,BMSCs旁分泌因子能够减少OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞ROS的产生,抑制炎症反应和水通道蛋白表达、促进神经营养因子和谷氨酸转运体的表达。以上结果提示,BMSCs旁分泌因子能够改善OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞功能的紊乱。本文内容结构第一章BMSCs旁分泌因子对大鼠MCAO模型脑损伤及损伤后星形胶质细胞活性和反应性增生的影响[目的]观察BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)对MCAO后大鼠脑梗塞面积和神经功能恢复的影响,推断BMSCs旁分泌因子在急性期缺血性脑损伤修复过程中对星形胶质细胞活性和反应性增生的作用。[方法]构建大鼠MCAO模型,在急性期(即栓塞2h,再灌注6h后)应用立体定向注射技术,依组分别向MCAO模型鼠损伤灶注射PBS (Venicle组)、BMSCs (BM组)或BMSC-CM(含旁分泌因子,CM组)对缺血性脑损伤进行实验性治疗。7d后,TTC染色法检测脑梗塞面积；改良NSS评分评估神经功能恢复情况;TUNEL检测神经细胞凋亡,免疫荧光和Western bolt检测Caspase3和GFAP蛋白表达。[结果]以下各组,组间差异均具有统计学意义(p<0.05)。局灶注射BMSC-CM(BM组)及BMSC-CM (CM组)均能够有效减少脑梗塞面积,促进神经功能恢复,与对照组(Venicle组)比较,差异均具有统计学意义(p<0.05),且BM组的改善效果比CM组更加明显(p<0.05)。另外,BMSC-CM及BMSC-CM均能减少损伤灶神经细胞的凋亡(p<0.05),抑制凋亡蛋白Caspase3的表达(p<0.05),且对星形胶质细胞的反应性增生具有明显抑制作用,显著减少GFAP的蛋白表达(p<0.05)。[结论]BMSC-CM (含旁分泌因子)对MCAO模型鼠的干预,与移植的BMSCs具有相似的治疗效果,能有效减少脑梗塞面积,促进神经功能恢复,并能减少损伤灶神经细胞的凋亡和星形胶质细胞的增生。提示,移植的BMSCs能通过旁分泌因子发挥上述疗效。第二章BMSCs旁分泌因子对OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞活性及反应性增生的影响及机制探讨[目的]进一步探讨BMSCs旁分泌因子对缺血性损伤后星形胶质细胞凋亡和反应性增生的调节作用及其机制。[方法]以体外构建的缺血性脑卒中模型(OGD模型)为基础,对损伤后星形胶质细胞用全培培养基(单纯OGD/再灌注组,Standard组)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned组)或采用Transwell共培养系统与BMSCs共培养(Co-cultured组)进行干预,以诱导星形胶质细胞的OGD/再灌注损伤。OGD 6h,再灌注24h后,CCK8检测损伤星形胶质细胞的活性,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和Caspase3的蛋白表达；免疫荧光检测损伤星形胶质细胞GFAP骨架蛋白表达,并观察肿大细胞数变化,Western blot检测GFAP蛋白表达情况。为进一步研究相关分子机制,p38 MAPK和JNK通路的抑制剂和激活剂,以及p38 MAPK和JNK下游通路p53和STAT1的抑制剂对上述模型加以干预,干预后采用同样方式检测损伤星形胶质细胞的存活和反应性增生情况。[结果]以下各组,组间差异均具有统计学意义(p<0.05) BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能够增加OGD/再灌注后损伤星形胶质细胞的活性(p<0.05)；减少细胞的凋亡(p<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p<0.05)和Caspase3(p<0.05),促进抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表达(p<0.05),与单纯OGD/再灌注组比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。另外,旁分泌因子还能减少肿大的星形胶质细胞个数,并能显著下调GFAP的过表达(p<0.05)。BMSCs及BMSC-CM干预后,单纯OGD/再灌注激活的p38 MAPK和JNK及其下游通路p53和STAT1均被抑制,p-p38、p-JNK、p-p53、p53和p-STAT1蛋白表达均显著下调(p<0.05)。与单纯OGD/再灌注组相比,p38 MAPK和JNK信号通路抑制剂,能够显著增加损伤星形胶质细胞的活性(p<0.05),减少细胞的凋亡(p<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p<0.05)和Caspase3 (p<0.05),促进抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表达(p<0.05)；并能显著下调GFAP的过表达(p<0.05)。单纯OGD/再灌注损伤的星形胶质细胞被p38 MAPK和JNK激动剂干预后,损伤星形胶质细胞的活性显著下降(p<0.05),凋亡数增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase3表达量增加(p<0.05),抑凋亡蛋白Bc12表达量下降(p<0.05),并增加了GFAP的表达(p<0.05); BMSC-CM加入p38 MAPK和JNK激动剂后,旁分泌因子对损伤星形胶质细胞活性的改善,细胞凋亡数和Bax,Caspase3, GFAP蛋白表达的抑制,Bcl2表达的促进作用均受到抑制(p<0.05)。另外,与单纯OGD/再灌注组相比,p53和STAT1信号通路抑制剂,能够显著增加损伤星形胶质细胞的活性(p<0.05),减少细胞的凋亡(p<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3,促进抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表达(p<0.05); STAT1能显著下调GFAP的过表达(p<0.05),p53则无此效果(p>0.05)。[结论]BMSCs旁分泌因子通过抑制p38 MAPK和JNK信号通路,进而保护OGD/再灌注后损伤的星形胶质细胞,减少细胞凋亡并抑制GFAP的过表达,且p38 MAPK和JNK信号通路的下游分子p53与STAT1也参与了该过程。因此,BMSCs旁分泌因子对缺血性脑卒中后损伤星形胶质细胞的药理学作用是缺血性脑卒中治疗的有效方式之一,其中p38 MAPK和JNK信号通路将会是潜在有效的治疗靶点。第三章BMSCs旁分泌因子对OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞其它生物学功能的影响[目的]初步探讨BMSCs旁分泌因子对OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞氧化应激、炎症反应、神经营养因子的分泌、水通道蛋白以及谷氨酸转运体表达的影响。[方法]以体外构建的缺血性脑卒中模型(OGD模型)为基础,对损伤后星形胶质细胞用全培培养基(单纯OGD/再灌注组,Standard组)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned组)或采用Transwell共培养系统与BMSCs共培养(Co-cultured组)进行干预,以诱导星形胶质细胞的OGD/再灌注损伤。OGD 6h,再灌注24h后,DCFH-DA检测ROS的产生,qPCR检测免疫调节蛋白和炎症因子(COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α和IL-10),神经营养因子(VEGF, BDNF和bFGF),水通道蛋白(AQP4)以及谷氨酸转运体(EAAT1和EAAT2)的mRNA表达情况。[结果]以下各组,组间差异均具有统计学意义(p<0.05)。BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能够减少ROS的产生,抑制免疫调节蛋白和促炎因子COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA表达,促进抑炎因子IL-10和神经营养因子VEGF,BDNF,bFGF的mRNA表达,并抑制水通道蛋白AQP4的mRNA上调和谷氨酸转运体EAAT1, EAAT2的mRNA下调,与单纯OGD/再灌注比,差异均具有统计学意义(p<0.05)。[结论]BMSCs旁分泌因子能够抑制OGD/再灌注后损伤的星形胶质细胞ROS的产生；并能抑制OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞免疫炎症反应,减少促炎的免疫调节蛋白和免疫反应因子的表达(IL-6,IL-1β,TNF-α,COX2,iNOS和TLR4),同时也增加促炎因子IL-10的表达；促进神经营养因子VEGF, BDNF和bFGF的表达；抑制OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞AQP4的过表达,减轻脑水肿；增加OGD/再灌注损伤后星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT1/EAAT2的表达,调节损伤后谷氨酸代谢的紊乱。