论文部分内容阅读
砂梨（Pyrus pyrifolia）,蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）梨属（PyrusL）植物,是中国重要的经济水果之一,主要在中国南方地区栽培种植早熟,为南方果农带来较大的经济效益。砂梨属于多年生落叶果树,具有冬季花芽休眠的特性,这为砂梨早熟优良品种的培育、栽培的南移推广以及栽培技术的推广带来了一定的难度。因此探究砂梨花芽休眠的相关机制,对砂梨尤其是短低温砂梨的产业健康发展具有十分重要的意义。本试验以福建主栽砂梨品种‘蜜雪’、‘黄花’为试验材料,利用全基因组数据和休眠时期转录组数据,分析5大类转录因子在‘蜜雪’花芽休眠期间的表达情况;同时研究了DAM基因在不同砂梨品种间的序列特征,并分析了不同条件处理下DAM基因的表达模式。主要结果如下:1.共筛选得到18条涉及WRKY、MYB、MADS-box、bZIP和HD-ZIP等5大类的转录因子。对它们在‘蜜雪’花芽休眠期间的表达模式分析表明,WRKY71、MYB1 08-like-2、MIYB36、PpbZIP、PpMADS13-1、PpMADS13-3、PpMADS21 和 PpMADS35 等基因的表达高峰分布在花芽休眠期、花芽内休眠解除临界期和休眠解除完成期,这表明了它们可能参与花芽休眠进程转换的调节机制;WRKY33、WRKY7等基因主要在深度休眠时期显著表达,可能参与了花芽深度休眠阶段的某种生理机制调控;MYB108-like-1、bZIP60、PpFT2α等基因在花芽萌动阶段显著表达,表明了它们主要参与了花芽的萌动;PpFLC-like-1、PpFLC-like-2基因均在花芽休眠解除完成前期1月16日显著表达,表明FLC基因可能是砂梨花芽休眠中的一个重要调节基因;MYB21-like、APL-like、ATHB-12-like等基因在生态休眠的阶段有较大的表达量,推测它们是响应低温的刺激而上调表达。2.成功地从‘黄花’和‘蜜雪’梨中分别扩增获得PpMADS13-1、PpMADS1 3-3、PpMADS21和PpMADS35这4条MADS-box基因序列,8条MADS-box序列均已登录GenBank。两个品种PpMADS13-1、PpMADS13-3、PpMADS21和PpMADS35的氨基酸序列相似度分别为100%、91.45%、100%和81.7%,PpMADS35的保守性较差。进化树分析,试验得到的8个MADS-box基因与酥梨PpDAM,苹果MdDAM聚类在一起,有较近的亲缘关系。其中,PpMADS21 与 PpMADS13-3、PpDAM1 的关系较近,PpMADS35 与 PpMADS13-1、PpDAM3的关系较近。可以判断PpMADS21和PpMADS35属于DAM同源基因。亚细胞定位分析显示,8个MADS-box蛋白均被定位在细胞核内。3.连续两年测定了‘黄花’4个DAM基因在花芽休眠期间的表达模式,其结果显示,不同于‘蜜雪’4个DAM基因丰富的波动变化,‘黄花’4个DAM基因均呈现出随着休眠的解除,表达量逐渐下降的趋势。并且在连续两年的测定中均发现,在内休眠解除临界期前后,DAM基因会有一个小的表达上调。扩大采样周期,发现,‘黄花’4个DAM基因均是在12月份的花芽休眠期间上调表达,验证了 DAM基因在休眠期间表达的结论。田间喷施破眠剂处理‘黄花’枝条,定量结果显示,对照组和处理组的4个DAM基因均呈现表达下调的趋势。单氰胺处理组的PpMADS13-1hh、PpMADS13-3hh和PpMADS21hh表达量在1月14日前均高于对照组,但随着生态休眠的深入,单氰胺处理组的表达量略低于对照组。推测,砂梨DAM基因可能受到低温以及自身休眠状态诱导。对‘黄花’梨枝条进行温室内喷施单氰胺处理以及低温处理,结果显示在25℃温室环境下,对照组和单氰胺处理组的4个DAM基因表达均骤然下调,单氰胺处理组表达量均略低于对照组;低温处理组4个DAM基因在前5天均维持较高表达,而后逐渐表达下调,表达量高于温室环境下培养的对照组和单氰胺处理组。‘蜜雪’温室内喷施单氰胺处理的试验结果与‘黄花’相似。为探索DAM基因是否为只在花芽内特异表达的一类基因,试验以‘黄花’和‘蜜雪’的韧皮部为材料,研究发现DAM基因在韧皮部中存在表达,说明DAM基因不是花芽内部特异表达的基因。上述结果表明,无论‘黄花’还是‘蜜雪’,其花芽的DAM基因都会在内休眠时期被诱导表达,同时其还受到低温诱导和高温抑制,在自然条件下休眠状态是其主要调控因子,度过内休眠阶段后,即使处于低温环境下其表达量也会逐渐下调。同时,DAM基因也受不同需冷量品种的影响,推测在较高需冷量品种中,DAM需持续的高表达来维持花芽的休眠状态;在低需冷量品种中,DAM只需在某特定阶段的特异表达即可使植株花芽维持休眠状态。4.CBF基因和FT基因是已有报道的可能参与DAM基因上下游调控机制的两种基因,本试验研究PpCBF和PpFT2a在‘黄花’和‘蜜雪’中的表达情况。结果显示,不同砂梨品种PpCBF的表达模式不同,与DAM基因的表达模式也不十分契合,无法得出CBF蛋白诱导DAM表达这一推论。‘黄花’和‘蜜雪’PpFT2a基因均随着休眠的解除上调表达,与DAM基因的表达模式相反,验证了DAM基因通过抑制FT基因的表达从而维持休眠的推论。5.克隆得到‘黄花’和‘蜜雪’PpMADS13-1、PpMADS13-3、PpMADS21基因的 ATG上游3000bp序列。启动子软件预测结果显示,3个基因的启动子序列均含有光调控顺式元件、激素应激相关顺式元件以及热应激及干旱等防御相关响应元件。‘蜜雪’PpMADS13-1mx启动子区域还发现了冷胁迫和干旱胁迫应答元件C-repeated/DRE,这可能是低温下‘蜜雪’PpMADS13-1mx基因表达水平更高的原因。这些结果表明DAM基因参与了激素响应、冷胁迫、干旱胁迫以及热应激等多种逆境应激相关反应,进而调控花芽休眠的相关进程。6.采用原核表达体系表达‘蜜雪’PpMADS13-1mx蛋白。以pEASY-Blunt E1作为连接载体,构建pEASY-PpMADS13-1原核表达载体,将表达载体转入BL21（DE3）中,获得表达菌株,经过0.5mmol/L IPTG诱导菌株表达6、24小时后,进行SDS-PAGE分析,在上清液和沉淀中均发现了目标条带,诱导表达成功。为下一步PpMADS13-1mx蛋白的功能验证奠定坚实的技术基础。