目的:近二十年来,随着纳米技术飞跃式的发展,各种纳米材料已经逐渐被广泛应用于人类生活的各个方面,包括化妆品、油漆、医疗产品、纺织品和个人护理产品等。纳米材料的广泛应用使人们越来越重视其生物效应和安全性。作为新型二维纳米材料,MXene（Ti3C2）纳米片具有比表面积大、含氧基团丰富以及易于规模化生产等优越的特性,目前在环境污染治理、肿瘤光热治疗、润滑剂、电池、抗菌材料等领域备受瞩目。然而关于MXene（Ti3C2）纳米片的安全性以及毒性效应的研究非常有限,尤其是对妊娠结局和子代的生物学效应以及相关机制亟待补充。本研究拟通过合成MXene（Ti3C2）纳米片,建立不同剂量MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露的小鼠模型,研究MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露后对妊娠及子代神经系统发育的影响,揭示妊娠过程中介导母体和胎儿交流的胎盘在MXene（Ti3C2）纳米片暴露后的功能变化,并通过基因组学和代谢组学的方法深入探究潜在的分子机制。旨在补充MXene（Ti3C2）纳米片的安全性研究和毒性效应评估,同时为纳米材料在人类生产生活中的规范应用提供理论依据。方法:1.MXene（Ti3C2）纳米片的制备与表征（1）MXene（Ti3C2）纳米片的制备:利用氟化锂（Li F）和盐酸（HCl）混合溶液作为刻蚀剂的方法对Ti3Al C2进行刻蚀,再利用蒸馏水清洗和氩气流下超声处理后得到分散的Ti3C2纳米片。（2）MXene（Ti3C2）纳米片的表征:利用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察结构和横向尺寸,利用原子力显微镜（AFM）分析厚度,利用X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）分析元素组成及化学状态。2.不同剂量MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露的小鼠模型建立选取6-8周龄,体重为30-33g性成熟的昆明小鼠,以查见阴栓记为妊娠第一天（GD1）,妊娠天数以此类推。妊娠第五天（GD5）开始连续三天尾静脉注射不同剂量的MXene（Ti3C2）纳米片溶液（剂量为0.5mg/kg、1.25 mg/kg、2.5 mg/kg）,分别以溶剂注射组和完全空白组作为对照。3.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露后小鼠宫腔内组织Ti元素含量测定利用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测小鼠GD8、GD9和GD10子宫中Ti元素的含量,以及GD12胎盘组织中Ti元素的含量以推断MXene（Ti3C2）纳米片在宫腔内组织中的沉积情况。4.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露对妊娠及子代神经系统发育的影响（1）妊娠结局观察:通过繁殖试验,观察妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露后小鼠的妊娠结局,包括孕鼠妊娠天数、每胎产仔数、新生小鼠的体重和外观形态。（2）子代神经行为学检测:利用Morris水迷宫测试成年子代小鼠的学习能力和空间记忆能力,利用高架十字迷宫实验评估成年子代小鼠的情绪状态,利用H＆E染色观察成年子代小鼠大脑海马和皮层组织的形态变化。5.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露对孕鼠妊娠状态的影响利用孕鼠GD5至GD12的体重增长曲线检测孕鼠的整体状态,统计分析GD12的重要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和卵巢）系数,利用组织切片H＆E染色观察以上重要脏器的形态。统计分析GD8、GD9、GD10和GD12的子宫脏器系数和着床点数量,观察胚胎植入后的子宫外观。利用DBA染色对子宫内u NK细胞进行标记,观察子宫内膜蜕膜区u NK细胞的募集情况。6.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露对胎盘发育及功能的影响利用免疫组织化学染色（IHC）的方法对GD8的子宫组织切片进行骨形态发生蛋白2（BMP-2）染色,观察外胎盘锥分化为滋养细胞的过程;对GD9子宫组织切片进行细胞角蛋白8（CK8）染色,观察胎盘形成前期绒毛板的厚度;利用H＆E染色观察GD12胎盘的形态结构。对GD12的胎盘组织切片进行血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和ki67染色,检测迷路层发育情况和滋养细胞增殖情况。计算并统计分析胎盘组织的脏器系数、胎盘系数以及胎盘组织各功能层切片的面积。TEM检测胎盘组织细胞的超微结构。收集各剂量组GD10和GD12孕鼠血清,利用ELISA检测血清中由胎盘分泌的β-CG、Pl GF和s Flt-1激素水平的情况。7.MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露影响胎盘及子代神经系统发育的机制研究（1）通过代谢组探讨MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露对孕鼠胎盘代谢的影响:利用气相色谱-质谱法（GC-MS）检测孕鼠GD12胎盘和血清中代谢物的情况,利用AMDI软件对所测代谢物进行定性分析。对有显著差异的代谢物利用KEGG进行相关信号通路富集分析,揭示MXene（Ti3C2）纳米片妊娠早期暴露损伤胎盘以及子代神经系统发育的潜在机制。（2）通过转录组探究MXene（Ti3C2）纳米片在妊娠早期暴露对孕鼠胎盘基因表达的影响:对GD12各剂量组的胎盘组织进行RNA-seq;对测序结果进行差异基因分析,绘制差异基因数量统计图、火山图和Circos图;对差异基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,揭示MXene（Ti3C2）纳米片暴露影响胎盘功能的主要生物学过程和信号通路,在代谢组学分析结果的基础上,筛选妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露损伤子代神经系统发育的重要差异分子及相关信号通路。结果:1.成功制备MXene（Ti3C2）超薄纳米片利用TEM和SEM测算MXene（Ti3C2）纳米片的横向尺寸约为1-2μm,利用AFM测算分析厚度约为2-3 nm,XPS、拉曼光谱和XRD的结果均显示了MXene（Ti3C2）纳米片的特征峰值,在溶剂中也具备较好的分散性。2.MXene（Ti3C2）纳米片在子宫以及胎盘中蓄积ICP-MS结果显示:在小鼠GD8、GD9、GD10子宫和GD12胎盘中均检测到Ti元素含量升高,其中2.5 mg/kg剂量组的升高趋势最显著,且差异具有统计学意义（p＜0.01）。3.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露不影响孕鼠妊娠结局MXene（Ti3C2）纳米片在子宫以及胎盘中沉积后,未造成孕鼠妊娠结局的异常,各剂量组之间孕鼠的妊娠天数、产仔数、新生鼠体重的差异均没有统计学意义（p＞0.05）。4.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露影响后代神经系统发育Morris水迷宫和高架十字迷宫实验结果显示:成年子代（出生后90天）表现出学习能力和空间记忆力下降以及情绪状态的改变。脑组织切片H＆E染色结果显示2.5 mg/kg剂量组的后代大脑海马神经元以及皮层组织神经元细胞数量减少、神经元细胞染色加深和细胞核固缩的改变。5.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露影响妊娠状态（1）GD5至GD12孕鼠体重监测结果显示:与对照组相比,2.5mg/kg剂量组的孕鼠体重增长减慢,且差异具有统计学意义（p＜0.01）。（2）重要脏器情况:各剂量组重要脏器系数（包括卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏）的差异没有统计学意义（p＞0.05）。与对照组相比,2.5 mg/kg剂量组子宫的脏器系数在GD12时显著降低（p＜0.01）。（3）植入位点情况:各剂量组在GD8、GD9、GD10和GD12时植入位点数量的差异没有统计学意义（p＞0.05）,但是通过观察外观发现2.5 mg/kg剂量组的植入位点出现了明显异常,包括植入间距不均匀、胚胎发育大小不均匀和子宫内出血的现象。（4）DBA结果显示:荧光染色阳性的细胞数目在GD8、GD9、GD10的子宫内膜蜕膜区域中未见明显变化。6.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露影响胎盘发育和功能（1）IHC的结果显示:与对照组相比,BMP-2在2.5 mg/kg剂量组GD8的外胎盘锥区域未见表达,CK8在2.5 mg/kg剂量组GD9的绒毛板染色区域减少。（2）H＆E结果显示:MXene（Ti3C2）纳米片暴露引起胎盘组织病理学改变,包括胎盘组织结构松散以及出血。与对照组相比,2.5 mg/kg剂量组的胎盘脏器系数、胎盘效率和迷路层表面积均显著减少,且差异具有统计学意义（p＜0.01）。（3）IHC结果显示:标记迷路层血管内皮细胞的VEGFR2广泛表达于MXene（Ti3C2）纳米片暴露后胎盘的海绵层。除此之外,ki67在胎盘的海绵层滋养细胞中表达明显升高。（4）孕鼠血清中胎盘特异性激素检测结果显示:β-CG和Pl GF在GD10和GD12时都随着暴露剂量的升高而显著升高,而s Flt-1随着暴露剂量的升高而显著降低,差异具有统计学意义（p＜0.01）。（5）TEM结果显示:与对照组相比,MXene（Ti3C2）纳米片暴露后胎盘组织内的脂滴随剂量升高逐渐增多。7.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露影响胎盘组织代谢（1）主成分分析（PCA）结果显示:与对照组相比,2.5 mg/kg剂量组胎盘组织中检测到的代谢物有显著改变,而血清中检测到的代谢物未见明显改变。（2）GC-MS结果显示:在胎盘组织中共检测到145个代谢物。与对照组相比,1.25 mg/kg剂量组只有5个代谢产物有显著升高,而2.5mg/kg剂量组有32个代谢物有显著改变,且差异有统计学意义（p＜0.05）,其中有5个显著降低,27个显著升高。在血清中共检测到152个代谢产物,各剂量组与对照组之间差异均没有统计学意义（p＞0.05）。（3）与对照组相比,2.5 mg/kg组在胎盘组织中有7个氨基酸类代谢物水平显著升高,包括了苏氨酸、赖氨酸、谷氨酸和组氨酸等必需氨基酸。除此之外,有6个长链不饱和脂肪酸类物质显著升高,包括DHA、亚油酸和神经酸等。（4）利用KEGG数据库,将2.5 mg/kg剂量组胎盘中差异显著的代谢物匹配分析进行模拟预测后发现:与对照组相比,2.5 mg/kg剂量组有26条代谢通路显著改变（p＜0.05）,其中有5条氨基酸代谢通路显著上调,分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路,精氨酸生物合成通路,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路。此外,还有3条脂质代谢通路显著下调,分别是亚油酸代谢通路、甘油脂代谢通路和鞘脂代谢通路。8.妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片暴露影响胎盘组织的基因表达（1）2.5 mg/kg剂量组和对照组胎盘组织转录组测序的结果显示:与对照组相比,2.5 mg/kg剂量组胎盘组织中表达有显著差异（|log2Fold Change|＞1,p＜0.05）的基因共计408个,其中显著上调的有306个,显著下调的有102个。（2）GO功能分析结果显示:与对照组相比,2.5 mg/kg组的差异基因主要参与了小分子代谢过程、脂质转运蛋白活性、脂质转运活性和脂质结合等功能。（3）KEGG信号通路富集分析结果显示:有16个差异基因参与了氨基酸代谢相关通路,其中显著上调15个,显著下调1个,分别参与了色氨酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和赖氨酸降解信号通路。有9个差异基因参与了脂质代谢相关通路,均为显著上调,分别参与了花生四烯酸代谢和脂肪酸降解信号通路。结论:（1）妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片经小鼠尾静脉暴露后可在胎盘等宫腔内组织沉积。MXene（Ti3C2）纳米片妊娠早期暴露组孕鼠的妊娠结局未见异常,但损伤子代神经系统发育和功能。（2）妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露引起滋养细胞增殖和分化异常,进而导致胎盘结构和功能的损伤。（3）妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露引起胎盘中部分代谢物质水平显著改变,其中谷氨酸和组氨酸水平的升高和相关转运蛋白表达上调增加了母体通过胎盘向胎儿转运氨基酸的效率,满足胎儿妊娠晚期生长发育的需求,确保胎儿出生后体重仍然可以维持在正常范围内。参与色氨酸代谢途径的关键基因显著上调,提示胎儿在早期神经系统发育过程中体内神经递质5-HT的缺乏以及神经毒性代谢物喹啉酸水平升高可能影响了胎儿神经系统正常发育过程。（4）在胚胎发育时期,胎盘中Cyp4a12a和Cyp4a12b的上调,长链脂肪酸分解代谢功能被激活。Mfsd2a下调,DHA的转运效率下降。胎盘对DHA的转运不足是造成子代的学习和空间记忆能力以及情绪状态改变的主要原因之一。综上,本研究首次证实妊娠早期MXene（Ti3C2）纳米片的暴露在不影响分娩结局的情况下,导致子代神经系统发育异常,同时伴有胎盘组织结构和激素分泌功能的损伤,这可能是子代小鼠神经系统功能异常的重要原因之一。同时胎盘氨基酸和脂质代谢紊乱以及必需脂肪酸转运障碍可能是MXene（Ti3C2）纳米片暴露导致子代神经系统发育异常的主要原因。以上研究结果补充了MXene（Ti3C2）纳米片的生物安全性研究,并为其生物负效应的防治提供实验依据。