【摘 要】
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植物衍生的miRNA参与人体调控的研究一直都是国内外研究热点,跨界调控人体的生物功能作用更是当下关注的重要课题。目前,有水稻衍生的Oryza sativamircoRNA（OsmiR168a、OsmiR156a 和 OsmiR166a）参与人体调控的编码基因,并且作用于多个组织器官。但OsmiR168家族中的OsmiR168b研究内容较少,其对人体的调控作用尚不清晰。本研究验证了湖南本地稻米在砻谷
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植物衍生的miRNA参与人体调控的研究一直都是国内外研究热点,跨界调控人体的生物功能作用更是当下关注的重要课题。目前,有水稻衍生的Oryza sativamircoRNA（OsmiR168a、OsmiR156a 和 OsmiR166a）参与人体调控的编码基因,并且作用于多个组织器官。但OsmiR168家族中的OsmiR168b研究内容较少,其对人体的调控作用尚不清晰。本研究验证了湖南本地稻米在砻谷、蒸煮、模拟体外消化后OsmiR168b的含量变化;结合生物信息学和分子生物学方法,探究OsmiR168b抑制HepG2细胞增殖作用及其机理。期望为稻米功能小分子物质的应用提供基础依据。本论文的研究结果如下:（1）湖南本地稻米中的OsmiR168b提取及含量测定。选取21HGMB03、佳优长晶、桂香18、华占、梓早7号、五小丝苗6个品种的稻谷和糙米,采用qRT-PCR检测其中OsmiR168b的含量,结果表明差异不显著（P＞0.05）,晚稻21HGMB03糙米的OsmiR168b含量最高,含量为0.51±0.01 nM。（2）21HGMB03糙米中的OsmiR168b在体外模拟消化的的结果。以含量最高21HGMB03糙米煮熟后检测OsmiR168b,检测其含量为0.36±0.01 nM;在体外模拟消化实验中口腔期15 min的OsmiR168b含量为0.34±0.01 nM;胃期45、75、105、135min的OsmiR1681b含量分别为0.20±0.08、0.15±0.04、0.14±0.03和 0.12±0.01 nM;肠期 165、195、225、255 min的OsmiR168b含量分别为0.10±0.02、0.10±0.001、0.08±0.017、0.08±0.10 nM。OsmiR168b 的含量在模拟消化系统中缓慢减少,胃期的消化率最高。（3）OsmiR168b及其靶基因的生物信息学分析。以Role of plant microRNA in Human（RPRH）（http://www.rnanut.net/rprh/）和生物信息学方法,筛选 OsmiR168b与肝癌细胞的相关途径和潜在靶标,其结果分别是VEGF通路的KDR、TGF-beta/Smad通路的PPP1CB、TGF-beta通路的SMAD3。三个基因的富集分析结果显示,KDR基因与肿瘤基因增殖相关;PPP1CB基因与信号转导相关;SMAD3基因与调节转录相关。（4）OsmiR168b抑制HepG2细胞增殖。由细胞活性试验可知OsmiR168b转染HepG2细胞48h后的抑制率最好。转染高浓度（150和200 nM）的HepG2细胞内活性氧量最高。细胞划痕试验和细胞集落试验都证实了 OsmiR168b浓度为150nM时,HepG2细胞的迁移率达到最低。（5）OsmiR168b抑制HepG2细胞增殖的分子机理。OsmiR168b可以靶向KDR调节VEGF信号通路,下调血管生成的关键基因和抗凋亡基因,达到抑制HepG2细胞增殖的功效。OsmiR168b转染HepG2细胞后,KDR、p-PIK3R3和p-AKT的RNA水平和蛋白水平都显著下调（P＜0.001）。RAF、RAC2的mRNA表达水平,p-mTOR和Bcl-2/Bax的蛋白水平均显著下调（P＜0.05）。Caspase-9蛋白水平显著上调（P＜0.001）。OsmiR168b能显著抑制细胞的增殖和血管生成的基因,促进HepG2细胞的凋亡。
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