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奶牛乳腺乳脂代谢受到诸多因素的调控,是十分复杂的过程。SIRT1基因是具有乙酰化作用的沉默信息调控子。SIRT1基因在脂肪细胞中高表达,在部分哺乳动物体内起到抑制脂肪生成的作用。目前关于SIRT1基因在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂代谢调控作用的研究报道较少。MicroRNA(miRNA)是一类转录后调控的非编码RNA,其可以通过调控靶基因的表达而间接地影响乳脂代谢过程。本实验室前期利用高通量测序技术分别对泌乳前7天和泌乳180天奶牛乳腺组织中miRNA的表达模式进行鉴定,分析得到bta-miR-141显著差异表达(P<0.05)。生物信息学分析表明,bta-miR-141靶向调控SIRT1基因。本研究以奶牛乳腺上皮细胞及人肾上皮细胞系(293T)为研究对象,运用甘油三酯含量测定、油红O染色、荧光定量PCR(qRT-PCR)、双荧光素酶报告基因以及免疫印迹等试验技术,研究bta-miR-141靶向SIRT1基因调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢的机制。所得结果如下:1、bta-miR-141功能探究:奶牛乳腺上皮细胞中分别转染miR-141模拟物(mimic)、阴性对照(mimic-NC)。48h后进行油红O染色。结果显示:以mimic-NC组为试验对照,miR-141 mimic组脂滴分泌提高(P<0.05)。进一步通过甘油三酯含量测定验证miR-141对乳腺上皮细胞中乳脂代谢产生的影响。结果显示:以mimic-NC组为试验对照,miR-141 mimic组甘油三酯含量显著提高(P<0.05)。以上结果表明:miR-141具有促进奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢的功能。2、bta-miR-141与SIRT1基因的靶向关系验证:将SIRT1基因3’UTR插入pmirGLO载体,构建出双荧光素酶野生型载体。种子区域突变后获得突变型载体。二者分别与miR-141 mimic及mimic-NC共转染至人肾上皮细胞系(293T),测得荧光活性。结果显示:以mimic-NC组为试验对照,野生型载体组中过表达miR-141后,萤火虫酶/海肾酶活性的比值(F/R)显著降低(P<0.05);突变型载体组中过表达miR-141后,萤火虫酶/海肾酶活性的比值无明显变化(P>0.05)。进一步在奶牛乳腺上皮细胞中转染miR-141 mimic、mimic-NC、miR-141 inhibitor 以及 inhibitor-NC。通过 qRT-PCR 发现,过表达 miR-141 能够显著抑制SIRT1基因的表达(P<0.05)。蛋白免疫印迹的验证结果与qRT-PCR的结果一致。以上结果表明:miR-141能够在mRNA和蛋白水平上抑制SIRT1基因的表达,SIRT1基因是miR-141的靶基因。3、bta-miR-141是否通过调控SIRT1基因对乳脂代谢相关基因产生影响的探究:奶牛乳腺上皮细胞中分别转染miR-141 mimic、mimic-NC,通过qRT-PCR试验检测乳脂代谢相关基因SREBF1、FASN、PPARγmRNA表达量。结果显示:以mimic-NC组为试验对照,转染miR-141 mimic后SREBF1、FASN、PPAγ mRNA表达量提高。设计干扰RNA(siRNA)敲降SIRT1基因的表达,奶牛乳腺上皮细胞中分别共转染siSIRT1、miR-141 mimic、mimic-NC 和 siSIRT1-NC。qRT-PCR 检测乳脂代谢相关基因SREBF1、FASN、PPARγmRNA表达量。结果显示:共转染siSIRT1与mimic-NC组、siSIRT1-NC与mimic组,SREBF1、FASN、PPARγ基因mRNA表达量均显著提高(P<0.05)。转染siSIRT1抑制SIRT1表达后,再转染 miR-141 mimic,SREBF1、FASN、PPARγ基因 mRNA 表达量无显著变化(P>0.05)。以上结果表明:miR-141通过调控SIRT1基因对乳脂代谢相关基因产生影响。综上所述,bta-miR-141靶向基因SIRT1基因调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢过程,miR-141通过抑制SIRT1基因表达而促进乳脂代谢相关基因的表达。本研究为解析microRNA调控奶牛乳脂代谢机制提供试验依据。