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NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,一些NAC转录因子在植物的次生细胞壁合成过程中起着非常关键的调控作用。棉花是世界上最重要的纤维作物,其成熟棉纤维次生壁含有超过90%的纤维素和极少量的半纤维素和木质素,但关于棉纤维次生壁合成调控的分子机制还不太清楚。实验室之前从棉花中分离出了 7个可能与纤维次生壁合成相关的NAC家族成员,命名为 GhFSN 1-7(Fiber Secondary cell wall-related NAC),GhFSN1 已经显示正调控棉纤维次生壁合成,但其它儿个GhFSNs的功能未知,本研究选取GhFSN5作为研究对象,对其功能进行了初步研究。同时,对其可能的下游靶基因:GhMYB85A、GhMYB85B、GhMYB85C也进行了初步分析。主要结果如下:1.GhFSN5与AtNST1,AtNST2,AtNST3 同源性较高GhFSN5基因的ORF长为1218 bp,共编码405个氨基酸残基。该蛋白具有NAC转录因子家族典型的结构特征,N端有一个保守的NAC结构域。GhFSN5基因的全长序列中含有三个外显子和两个内含子。SALAD系统进化树分析发现,GhFSN5与拟南芥次生壁合成主调控因子AtNST1,AtNST2,AtNST3位于同一进化分支上;它们含有类似的结构域组成;共表达网络分析显示,GhFSN5与大量次生壁合成相关基因共表达。2.GhFSN5在棉纤维次生壁加厚期高表达。qRT-PCR分析显示GhFSN5在15DPA纤维中表达量最高,在18DPA,20DPA纤维中表达水平也较高,因此GhFSN5可能在棉纤维次生壁加厚期中发挥一定的作用。为进一步研究其表达特点,分离了 GhFSN5起始密码子之前的2023bp的上上游启动子序列,构建GhFSN5 Promoter与GUS的融合表达载体,转化拟南芥,染色分析显示在转难因拟南芥的花和茎中GUS信号最强,暗示此基因可能参与调控次生壁合成。3.GhFSN5负调控花序茎次生壁合成和花药发育为研究GhFSN5可能发挥的功能,构建了其过量表达载体,并转化拟南芥。过表达GhFSN5转基因拟南芥与野生型拟南芥相比,长势一致,但转基因拟南芥角果变小且不饱满,种子数量显著减少。为研究GhFSAN5是否参与调控次生壁合成,对转基因拟南芥7周花序茎基部第一节间进行石蜡包埋,纤维索特异染料S4B和荧光增白剂染色切片发现,与野生型相比,过表达转基因茎中荧光强度显著降低,暗示纤维素含量降低,根中也有类似的结果。此外,间苯三酚染色木质素的结果也显示过表达植株中木质素含量减少。进—步通过qRT-PCR对次生壁合成相关的基因分析显示,参与次生壁纤维素,半纤维素和木质素合成的基因在过表达植株中表达量降低。我们还构建了 GhFSN5的回补载体,转化Atnst1/Atnst3双突变体,由于维管束间纤维缺失次生壁的加厚,Atnst1/Atnst3双突变体植株倒伏,GhFSN5基因导入并不能回复双突变体的表型,进一步暗示该基因并不能发挥与AtNST1、AtNST2、AtNST3类似的功能。所有上述结果表明GhFSN5负调控次生壁合成。此外,与野生型相比,转基因植株花的解剖结构未见明显改变,但野生型植株雌蕊花柱上附着较多花粉,而转基因雌蕊花柱比较光滑未见花粉附着。野生型花药花粉散出多,而转基因花药花粉很少散出。进一步对花药扫描电镜分析显示野生型花药与转基因花药开裂并未见明显差异,但转基因花粉皱缩,坍塌,可能是导致转基因拟南芥的花药不能正常散粉及种子变少的主要原因。4.可能位于GhFSN5下游的三个MYBs基因的克隆与功能研究考虑到参与次生壁合成的NAC-MYB转录调控网络在维管植物中有一定的保守性,我们从棉花cDNA文库中分离了三个可能位于GhFSN5下游的MYB转录因子,这三个MYB转录因子与AtMYB85高度同源,分别命名为GhMYB85A,GhMYB85B,GhMYB85C。基因结构分析,该三个MYB基因具有典型MYB转录因子的结构特征。自激活检测显示GhMYB85A具有自激活活性,GhMYB85B,GhMYB85C无自激活活性。组织表达分析显示,GhMYB85A,GhMYB85B在20DPA、25DPA纤维中表达量较高,可能在棉纤维次生壁合成中起作用。为了研究它们是否参与次生壁合成,构建了过表达载体,转化拟南芥。尽管转基因拟南芥与野生型拟南芥生长未见明显差异。但对7周拟南芥茎的切片经问苯三酚染色的结果显示,与WT相比,过表达GhMYB85A转基因拟南芥花序茎木质部导管细胞染色增强,暗示木质素含量增多,木质化增强。在根中也获得了类似的结果。表明GhMYB85A可能参与调控次生壁合成。