氯喹,是一种广泛用于预防和治疗疟疾以及治疗自身免疫性疾病的基础公共卫生体系必备药物,被发现具有一定抗病毒作用,同时还是一种常用的自噬抑制剂,近期更是因其在新冠肺炎病毒治疗中的争议性作用而备受关注。然而,有关氯喹在水生生物中的相关研究还非常有限。对于水体中氯喹对鱼类不同器官的影响及其作用机制的研究尚未展开,给系统理解鱼类对氯喹的自噬响应机制及水体中氯喹的潜在环境威胁带来巨大障碍。本研究以成年斑马鱼为对象,探讨不同浓度氯喹对斑马鱼行为学、存活率的影响,确定96h的半致死浓度LC50,比较不同浓度氯喹对鳃、脾、精巢和卵巢组织的亚显微结构影响,同时比较研究斑马鱼鳃、肝、脾、胃、肠、肾、心、肌、皮、眼、脑、精巢和卵巢13个组织中自噬相关基因LC3/BECN1和Cx43对高中低浓度氯喹的响应模式,包括最快响应时刻、表达峰值出现时刻以及表达量升高(降低)倍数。揭示不同组织对梯度浓度氯喹的响应规律,获得最适靶组织及对应最适检测时间。从而从行为学、存活率、组织学和分子生物学层次共同阐明斑马鱼对氯喹的自噬响应机制,为进一步研究氯喹对鱼类的影响提供重要基础数据,同时为阐明水体中氯喹的潜在环境影响提供科学依据。主要研究结果如下:1.不同浓度氯喹对斑马鱼存活率的影响及96h半致死浓度(LC50)的研究通过高(2.5mg/mL)、中(1.0mg/mL)、低(0.1mg/mL)三个浓度组的氯喹处理实验发现,斑马鱼的死亡率与氯喹浓度之间存在很强的相关性,随着氯喹浓度的升高和处理时间的推移,首次出现斑马鱼死亡个体的时间和达到死亡高峰的时间逐步提前。通过寇氏法得到氯喹对成年斑马鱼96h的半致死浓度(LC50)为1.12mg/mL,与概率单位法进行验证结果(1.0mg/mL)基本一致。组织学研究表明,不同浓度氯喹处理后各组织均出现了较明显的损伤。其中,鳃组织主要表现为上皮水肿和组织空泡化,其变化程度与氯喹的浓度呈正相关。脾组织和卵巢滤泡细胞边缘均出现了不同程度的组织空泡化、凋亡小体和自噬溶酶体数量增多。精巢中精母细胞和Sertoli细胞内出现囊泡增加,自噬溶酶体及凋亡小体增加的现象;且低浓度组中,精母细胞的细胞核、细胞质出现了严重的崩解和自溶现象,反映出氯喹对精子发生过程的强烈干扰。这些组织中出现的自噬小体(自噬溶酶体)和凋亡小体数量上的显著增多,表明水体中氯喹对自噬系统的强烈干扰,及其对凋亡系统的触发反应,与斑马鱼的大量死亡也相对应。2.斑马鱼各组织自噬标记基因LC3/BECN1对不同浓度氯喹的响应研究对照组中LC3在皮肤中表达量最高。高、中浓度组中,鳃、肝、脾、胃、肠、肾、心、肌、眼、精巢和卵巢中的LC3表达量均显著升高,皮肤的LC3表达量均显著降低;且中浓度组各组织LC3最快响应时刻和到达峰值(极值)的时刻与高浓度组相比,均发生了不同程度的滞后(脑无变化),表明各组织中LC3对氯喹的响应存在明显的剂量依赖性。高、中、低浓度氯喹均引起卵巢、鳃和脾的LC3表达量显著升高,且浓度越高LC3的升高倍数越大;其中鳃的最快响应时刻集中于0.5h-1h,脾的最快响应时刻和峰值出现时刻相对滞后于鳃;卵巢的最快响应时刻集中于2h-4h,峰值出现时刻也晚于鳃和脾组织;精巢的LC3在高、中浓度组中变化趋势与鳃、脾和卵巢类似,出现了明显的升高,且升高倍数与氯喹浓度呈正相关。对照组中BECN1在皮肤中表达量最高。高、中浓度组中鳃、肝、脾、胃、肾、心、肌、眼、脑和卵巢组织的BECN1均出现了显著上升,且鳃和脾的上升最为显著;胃、肾、心和卵巢的BECN1表现出一致的变化模式;精巢、皮肤和肝的BECN1均显著下降;与LC3的结果类似,中浓度组各组织BECN1最快响应时刻和到达峰值(极值)的时刻均不同程度地落后于高浓度组,表现出明显的剂量依赖性。低浓度组中,鳃和卵巢的最快响应时刻均集中于0.5-1h。脾组织对高、中浓度组表现出极高的敏感性,高浓度组脾的BECN1升高倍数更高,最快响应和峰值出现更早;但在低浓度组中没有显著变化,证明其对氯喹的响应浓度最低阈值在0.1-1.0mg/mL区间内。精巢的BECN1表现出对氯喹非常高的敏感性,三个浓度组中变化趋势非常一致,均于0.5h出现显著下降,随后一直保持在低水平直至实验结束,且最低值出现的时刻随浓度降低发生了提前。3.斑马鱼各组织自噬相关基因Cx43对不同浓度氯喹的响应研究对照组中Cx43在眼的表达量最高。综合比较高、中、低三个浓度组可以发现,随着氯喹浓度的降低,各组织Cx43最快响应时刻和到达峰值(极值)的时刻均发生了不同程度的滞后(中浓度脾除外),表明Cx43对氯喹的响应存在明显的剂量依赖性。除了中浓度肠组织,高、中浓度的其他组织的Cx43表达量均出现显著升高;其中脾、精巢和卵巢中Cx43的升高最为显著,而鳃组织始终处于响应最快速的组织之列(0.5h-1h),同时这些组织的总体变化趋势规律性较明显,最高表达量的升高倍数与氯喹浓度呈正相关,即浓度越高表达量的升高倍数越大。低浓度组的Cx43出现了周期性波动现象,且随着时间推移波动周期有所延长。综合分析解剖学、组织学以及LC3/BECN1和Cx43中的结果,我们认为鳃、脾、精巢和卵巢是研究不同浓度氯喹对斑马鱼自噬相关基因LC3/BECN1和Cx43影响的理想靶组织。同时我们还获得了研究不同浓度氯喹对斑马鱼LC3/BECN1和Cx43表达影响的最佳检测时期,为今后相关领域的研究提供了重要的科学依据和有益探索。