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目的通过组织工程学的方法，利用壳聚糖纳米微粒的缓释作用，构建rhBMP-2与bFGF序贯缓释系统，然后复合于去抗原处理的猪松质骨（Antigen-extractedxenogeneic cancellous bone，AXCB），移植于小鼠腓骨肌袋进行异体成骨效能研究。通过动物实验，研究rhBMP-2与bFGF联合应用时不同缓释顺序对去抗原猪松质骨异体移植的成骨效能的影响，探讨rhBMP-2与bFGF分别在骨形成过程中的作用机制及相互作用的机制。设计并证明具有良好促骨形成效能的rhBMP-2与bFGF序贯缓释系统，为进一步的实验研究及以后的临床应用提供理论基础和实验依据。方法实验一：采用表面涂覆/沉积的方法，利用壳聚糖纳米颗粒包裹rhBMP-2小分子与bFGF小分子构建CS/rhBMP-2/bFGF序贯缓释系统，并将该复合纳米颗粒涂覆于去抗原处理后的猪松质骨块的骨小梁结构表面，然后扫描电镜观察形态、比重法检测孔隙率，压缩模量测试检测生物力学性能；实验二：进行材料载药与体外释放实验，通过包封率和载药量的测定来确定材料的载药能力，并计算药物的缓释时间，描绘缓释曲线，验证复合移植骨材料的成功制备。实验三：设计动物实验研究方案，进行材料组织相容性及异体成骨效能的研究。选取约30g重的昆明SD小鼠64只，随机分为实验组及对照组两大组，其中实验组按照CS/rhBMP-2/bFGF序贯缓释顺序的不同分为6组：①实验组A：AXCB+rhBMP-2/bFGF，②实验组B：AXCB+CS/rhBMP-2/bFGF，③实验组C：AXCB+rhBMP-2/CS/bFGF，④实验组D：AXCB+bFGF/CS/rhBMP-2，⑤实验组E：AXCB+CS/rhBMP-2，⑥实验组F：AXCB+CS/bFGF；对照组又分为两组：⑦空白对照组G：AXCB+CS，及⑧阴性对照组H：不植入任何材料组。于2w、4w两个时间点分别处死动物后获取标本，进行大体标本观察与称重、μCT观察骨组织显微三维结构、骨参数测量分析、钙含量检测、组织形态学染色（HE染色）以及组织化学染色（ALP免疫组化染色及CD34免疫组化染色）等。对实验得到的所有数据均以x±s表示，应用SPSS13.0软件，采用完全随机设计的单因素方差分析、多个样本均数两两比较的SNK-q检验等方法对数据进行统计分析，以α=0.05为检验水准，规定P<0.05为差异具有统计学意义。结果实验一：AXCB/CS/rhBMP/bFGF序贯缓释系统的制备与表征1.1扫描电镜结果显示去抗原猪松质骨块具有疏松多孔状结构，且附载的CS/rhBMP-2/bFGF缓释系统呈约100纳米的颗粒状结构吸附于骨小梁表面；1.2孔隙率测定结果显示去抗原猪松质骨块具有高达85%的孔隙率，且吸附不同缓释顺序的生长因子纳米颗粒后，其孔隙率均没有发生较大的改变，均保持在85%-86%之间；1.3力学性能分析结果显示去抗原猪松质骨块的压缩模量为13.44MPa，吸附不同缓释顺序的生长因子纳米颗粒后，其压缩模量均没有发生较大的改变，均保持在12MPa-14MPa之间，且其强度均能达到骨组织工程对于植入材料强度的要求；实验二：AXCB/CS/rhBMP/bFGF序贯缓释系统的载药及释放研究2.1各组材料中rhBMP-2及bFGF的包封率均较为接近，分别在55%及60%以上；且各组材料中rhBMP-2及bFGF的载药量也较为接近，分别在22‰及0.012‰左右；2.2体外释放试验所描绘的释放曲线可知，rhBMP-2与bFGF同时暴释组分别在第9天达到rhBMP80%的累积释放率及第13天达到bFGF70%的累积释放率；rhBMP-2与bFGF同时缓释组则rhBMP-2与bFGF持续释放至第23天；rhBMP-2先暴释，bFGF后缓释组中rhBMP-2第9天就达到80%的累积释放率，而bFGF第8天开始释放，持续释放至第26天累积达70%；bFGF先暴释，rhBMP-2后缓释组中bFGF第13天就达到70%的累积释放率，rhBMP-2第7天开始释放，持续释放至第28天累积达80%。单纯rhBMP-2缓释组中rhBMP-2持续释放至第24天时累积释放率才达到80%；单纯bFGF缓释组中bFGF持续释放至第22天时累积释放率才达到70%。实验三：AXCB/CS/rhBMP/bFGF序贯缓释系统的异体成骨实验3.1大体观察及称重结果显示，A-2、B-2、C-2、A-4、B-4、C-4、D-4、E-4材料重量明显高于术前材料重量（P<0.05）；2周时A组材料重量高于其他组别（P<0.05）；4周时B组材料重量高于其他组别（P<0.05）；且B、E组4周时材料重量高于2周时（P<0.05）；3.2钙含量检测结果显示2周时各组材料钙含量浓度值比较为A、C组>B组>D、E、F、G组(P<0.05)，且A组的钙含量浓度最大(348.5±9.66mg/dL)；4周时为B组>A、C、D、E组>F、G组(P<0.05)，且B组的钙含量浓度最大(414.7±12.03mg/dL)。同时B、D、E组4周时的钙含量浓度均高于2周时(P<0.05)，分别高出123.1mg/dL、78.2mg/dL、88.3mg/dL;3.3μCT扫描及骨参数分析结果显示，所有植入的去抗原猪松质骨块的骨体积、骨表面积及骨体积分数均相近(P>0.05)；而骨矿物质密度分析发现，2周时各组材料骨密度值比较为A、C、E组>B组>D、F、G高(P<0.05)，且A组的骨密度值最大(307.09±8.27mg/cc)；4周时为B组>A、C、D、E组>F、G组(P<0.05)，且B组的骨密度值最大(367.52±11.64mg/cc)；同时A、B、D、E组4周时的骨密度值均高于2周时(P<0.05)，分别高出32.55mg/cc、89.06mg/cc、38.18mg/cc、29.57mg/cc；骨小梁厚度分析发现，2周时各组材料骨小梁厚度比较为A组>B、C、E组>D、F、G高(P<0.05)，且A组的骨小梁厚度最大(95.33±7.28μm)；4周时为B组>A、C、D组>E、F、G组(P<0.05)，且B组的骨小梁厚度最大(126.17±11.36μm)；同时A、B、C、D组4周时的骨小梁厚度均高于2周时(P<0.05)，分别高出14.51μm、39.75μm、23.15μm、22.49μm；3.4H.E.染色结果显示A组、B组、C组、D组及E组在组织学H&E染色结果中均可见较大区域的钙化软骨及造血组织的形成，在新生的钙化软骨上可见透亮的软骨细胞及软骨边缘可见的骨母细胞衬里于软骨边缘，同时，在新生的软骨与植入的异种骨小梁及周围软组织之间可见红细胞充盈的造血组织，其中深染的细胞为造血细胞，红染的细胞为血红细胞。3.5碱性磷酸酶免疫组化染色结果显示，全部植入材料的小鼠部位均可见不同程度程度的ALP阳性表达区域，主要位于新生软骨的外周，表达于软骨细胞的胞浆内。其中A-2组、A-4组、B-4组、C-4组、D-4组及E-4组中ALP的阳性表达要高于其他组；3.6CD34免疫组化染色结果显示全部植入材料的小鼠部位均可见不同程度程度的CD34阳性表达区域，主要表达于血管内皮细胞的胞膜和胞浆。A-2组、A-4组、B-4组、C-4组、D-4组及F-4组中CD34阳性表达要高于其他组。结论1本实验已成功完成对AXCB/CS/rhBMP-2/bFGF序贯缓释系统的制备、表征、体外释放及小鼠体内成骨效能的研究。2本实验制备的AXCB/CS/rhBMP-2/bFGF序贯缓释系统具有理想的疏松多孔状结构，生物力学性能满足骨组织工程要求，显微结构形貌观察可见壳聚糖包裹生长因子的纳米颗粒成功地吸附于骨小梁结构表面，且各组材料中rhBMP-2与bFGF的总量及其各自所占移植材料总质量的比例之间无差异；3体外释放实验证实了AXCB/CS/rhBMP-2/bFGF序贯缓释系统的成功制备，各组材料中rhBMP-2与bFGF均按照实验设计实现先后的缓慢释放顺序。4动物实验结果均表明2周时，rhBMP-2与bFGF同时暴释组诱导去抗原猪松质骨的成骨效能最高；而4周时，则是rhBMP-2与bFGF同时缓释组诱导去抗原猪松质骨的成骨效能最高；鉴于新骨形成及矿化的周期时间，rhBMP-2与bFGF同时缓释是最为理想的释药方式，对去抗原猪松质骨异体移植具有更好的诱导成骨作用。