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1.研究背景在临床微生物学领域,对微生物尤其是细菌的鉴别和诊断一直沿用基于传统的的表型鉴定方法,主要包括细菌的分离、培养和表型鉴定等步骤。其主要的鉴定依据如形态学特点、染色特征及代谢特征等,其区分度较低,并且操作繁琐,耗时数天至数周,且不能够准确的反映菌群的组成和多样性,特别对于培养要求苛刻、易死亡或无法培养的细菌,传统方法尤显其不足。检测方法的滞后及报告时间的延迟一直为临床科室所诟病,不仅延误了疾病的诊断,更促进了经验用药和抗生素不合理使用。近年来,日新月异的分子诊断技术则令细菌鉴定由传统的生化鉴定转变到分子鉴定水平。2.研究目的建立全细胞荧光原位杂交技术(whole cell Fluorescence in situ hybridization, FISH),快速筛查孕妇无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)定植,与标准的分离培养方法进行比较,评价其检测效能,并评估该方法用于产前筛查的临床应用价值,同时分析本地区孕妇无乳链球菌定植水平,为及时预防围产期及新生儿无乳链球菌感染,降低新生儿感染的发病率和死亡率提供了理论和技术基础。初步建立基于PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI TOF MS)的细菌鉴定方法。3.研究方法随机收集武汉大学人民医院产科门诊及住院的孕妇1216例,按照美国疾病预防与控制中心(CDC)推荐的方法采集阴道拭子样本,并分别采用常规细菌培养法和全细胞荧光原位杂交法进行无乳链球菌检测。评价荧光原位杂交法的重复性、特异性评价、和敏感性等指标,了解本地区孕妇人群中无乳链球菌定植的水平,并按照美国临床与实验室标准化协会(Clinical and laboratory standards institution, CLSI)的建议,对无乳链球菌临床菌株进行体外药敏试验,了解本地区本地区无乳链球菌的流行菌株对对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、氯霉素、利奈唑胺、氧氟沙星及万古霉素9种常用抗生素的耐药情况。针对常见临床病原菌设计3对引物,首先扩增细菌的16s rDNA基因片段,然后体外转录为RNA,再使用RNase T1对RNA片段进行酶切消化,然后分别使用2种不同的纯化脱盐方法Ziptip柱和Oligo beads处理水解消化的产物,最后将处理完毕的样品分别与2,4,6-三羟基苯乙酮(2’,4’,6’-Trihydroxyacetophenone,THAP)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-Hydroxypicolinic acid,3-HPA)及6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(6-Aza-2-thiothymine, ATT)3种不同的基质混合上样,进行MALDI TOF MS检测,首先比较2中样品纯化脱盐的方法和3种不同的基质间不相搭配对试验结果的影响,通过分析质谱数据,选择最优的技术路线确定为检测方法——使用Ziptip柱处理样品和用3-HPA作为MALDI基质。应用建立的质谱技术,初步检测了大肠埃希菌和伤寒沙门菌,通过使用特征峰分析和评分等方法对细菌进行鉴定。4.结果方法学评估显示荧光原位杂交法具有较好的重复性,最低检出限达到103～104CFU/ml,同时具有较高的特异性和灵敏度,耗时仅3小时,大大少于培养法。在检测的1216例阴道拭子样本中,培养法和荧光原位杂交法共检出213例样本携带有无乳链球菌(17.5%)。其中培养法检出141(11.6%)例样本无乳链球菌阳性,荧光原位杂交法检出198(16.3%)例样本无乳链球菌阳性。培养法和荧光原位杂交法的敏感度分别为66.2%和93.0%,两种方法的特异性和阳性预测值均为100%,阴性预测值分别为93.3%和98.5%。我们对使用传统培养方法分离得到的无乳链球菌菌株中的113株分离株进行了抗生素敏感试验。根据美国CLSI推荐的抗生素组合,我们检测了无乳链球菌临床分离株对青霉素、红霉素等9种常用抗生素的耐药情况,结果显示,本地区无乳链球菌所有分离株株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、利奈唑胺及万古霉素均表现为敏感；对红霉素、克林霉素、氯霉素及氧氟沙星的耐药及中介比例高达65.5%、66.4%、36.2%和32.8%,并且有39株菌(34.5%)表现为多重耐药。成功建立了PCR-质谱联用检测检测细菌保守基因从而对细菌感染进行快速检测的方法,选择细菌16S rRNA为检测靶位,在进行体外转录时用aa-UTP替代普通UTP,提高了生物质谱的分辨能力,在综合比较了2种对水解产物的纯化脱盐方法及3种用于核酸的MALDI基质以后,选择了最优化的技术路线,通过特征峰分析法和评分法两种方法对质谱数据进行分析判读,最终确定待测目标细菌的种属,完成生物质谱技术对细菌的鉴定过程,最终成功对大肠埃希菌和沙门伤寒菌进行质谱快速鉴定。5.结论全细胞荧光原位杂交技术及PCR技术结合生物质谱技术检测临床病原菌是快速高效、简单易行且效费比高的技术平台,值得进一步挖掘和完善,以期更好地服务于临床日常工作。