宫颈癌最常见的女性生殖道恶性肿瘤,发病率和病死率居生殖道恶性肿瘤首位。每年全世界大约有53万新发病例,约50%患者死于该疾病,其中的80%来自发展中国家。早期宫颈癌一般推荐采用手术治疗,对于晚期转移和复发的病例,则失去了手术机会,常规采用化疗和放疗。然而,由于耐药的发生,患者身体耐受状况的恶化,放、化疗效果十分有限。因此,深入探讨宫颈癌发病机制,寻找更为安全有效、靶向性强的宫颈癌防治办法意义重大。靶向抑制组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)是一种目前非常有前景的肿瘤治疗手段。组蛋白的乙酰化修饰是一种重要的基因表达调控模式,由HDAC和组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyl-transferase, HAT)共同调节。研究证实,脱乙酰化作用过度,导致一系列肿瘤抑制基因下调／沉默,在肿瘤的发生过程起到关键作用；在宫颈癌组织中,HDAC活性异常增高；宫颈脱落细胞学发现组蛋白H3乙酰化水平与宫颈上皮内瘤变(cervival intraepithelial neoplasia, CIN)程度相关。因此,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)是一种潜在的宫颈癌靶向治疗药物。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是一种上皮细胞生长和分化的调节剂,可以诱导发生转化的细胞重新进入分化程序,而被用于肿瘤的防治。ATRA与受体(retinoic acid receptor, RAR)结合,尤其是RARβ2,才能发挥抗肿瘤作用。RARβ2作为一种重要的肿瘤抑制基因,由于启动子区域的甲基化和／或去乙酰化修饰而在包括宫颈癌在内很多肿瘤中的表达被沉默。有研究报道,HDACi可以上调多种肿瘤RARβ2的表达。因此,HDACi联合ATRA能否重启宫颈细胞RARβ2的表达,并发挥协同抗肿瘤作用值得深入研究。本课题将分析临床宫颈癌组织中组蛋白乙酰化水平与肿瘤抑制基因(Tumor suppressor genes, TSGs)表达及相关病理参数的关系；深入探讨HDACi (VPA和SAHA)联合ATRA对宫颈癌细胞RARβ2的表达的影响,从表观遗传修饰角度来阐明调控机制；通过体外实验,研究HDACi联合ATRA的抗宫颈癌作用,并深入探讨分子机制；建立人宫颈癌移植瘤模型,进一步评价疗效和验证分子机制。主要研究结果如下：1宫颈癌组织中组蛋白乙酰化水平和RARβ2及其下游基因的表达显著降低,甚至缺失：选取高、中、低分化的宫颈鳞癌组织65例,免疫组化检测AcH3、RARβ2、 E-cadherin和β-catenin的表达并评分。结果显示,随着宫颈癌组织分化程度的降低,AcH3、RARβ2、E-cadherin和p-catenin的表达逐渐降低、甚至缺失；组蛋白H3的乙酰化水平与RARβ2、E-cadherin和β-catenin的表达呈显著的正相关性(r=0.560, r=0.731, and r=0.733, P均<0.01)。表明,宫颈癌的进展过程中存在表观遗传修饰的异常,后者可能参与调控肿瘤抑制基因RARβ2. E-cadherin和β-catenin的表达。2HDACi联合ATRA显著提高宫颈癌细胞株AcH3水平,重启RARβ2表达：HDACi联合ATRA处理宫颈癌细胞株HeLa和SiHa48h后,基因表达谱芯片和Q-PCR结果证实RARβ2表达重启,转录水平显著上调,而RARα和RARγ则为组成性表达；WB显示组蛋白乙酰化水平显著提高,RARβ2表达量显著上升。3AcH3与RARβ2启动子区域RARE结合,启动RARβ2表达：以往研究证实,组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化与基因转录活化相关。我们采用H3K9ac抗体进行ChIP实验,结果显示HDACi联合ATRA通过提高H3K9ac水平,后者再与RARβ2启动子区RARE结合,从而重启RARβ2表达。4HDACi联合ATRA显著抑制宫颈癌细胞增殖1) HDACi联合ATRA抑制宫颈癌细胞增殖能力： MTT实验显示,HDACi与ATRA联合有效抑制宫颈癌细胞增殖,细胞增殖抑制率显著高于VPA和ATRA单一应用(P<0.01),甚至优于1mgL顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用(P<0.01)；ATRA对pIRES2-RARβ2-EGFP稳转宫颈癌细胞株的抑制作用与联合用药效果无显著差异(P>0.05),表明HDACi重启宫颈癌细胞RARβ2表达,提供了与ATRA协同抗肿瘤作用的分子基础。药物处理后,Ki67的表达明显减少,细胞集落形成能力被显著抑制,联合用药效果优于任一药物单用(P<0.01),再次验证了HDACi和ATRA的协同／相加抑制宫颈癌细胞增殖的作用。2) HDACi联合ATRA引起宫颈癌细胞G1期阻滞：HDACi和ATRA处理宫颈癌细胞株48h后检测细胞周期,结果显示联合用药使细胞株发生G1期阻滞；WB结果表明,HDACi和ATRA显著上调P21CIP1和P53的表达,而p-Stat3水平显著降低,Cyclin D1水平仅轻微下调。3) HDACi联合ATRA诱导宫颈癌细胞分化：细胞进入分化程序前需脱离细胞周期,WB和免疫组化结果证实,HDACi联合ATRA显著提高上皮细胞分化标志物Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表达；FACS和WB结果显示,药物处理后未引起细胞凋亡的显著增加。4) HDACi联合ATRA通过E-cadherin/PI3K/Akt通路诱导细胞分化：WB显示药物联合处理上调E-cadherin/β-catenin和p-Akt水平；分别采用LE-135拮抗RARβ2、siRNA沉默E-cadherin、LY-294002抑制PI3K活性、和siRNA沉默Akt1/2表达,可以阻断诱导分化作用。表明,HDACi联合ATRA重启RARβ2表达,通过E-cadherin-PI3K/Akt通路诱导宫颈癌细胞分化。5HDACi联合ATRA抑制裸鼠皮下移植瘤的生长：分别将5×106HeLa和SiHa细胞裸鼠背部皮下注射,建立移植瘤模型。治疗4周后,联合用药显著抑制肿瘤生长,肿瘤体积显著小于VPA组和ATRA组(P<0.01),与顺铂治疗组无显著差异(P>0.05)。与体外实验结果一致,WB显示药物联合处理显著提高组蛋白乙酰化水平,重启宫颈癌细胞RARβ2并上调P21CIP1和P53的表达,而Stat3磷酸化水平显著降低。免疫组化显示,联合药物处理抑制Ki67表达,增强上皮细胞终末分化标志Filaggrin、Loricrin、和Involucrin的表达。6建立人宫颈癌组织裸鼠皮下移植瘤模型,验证HDACi联合ATRA对宫颈癌的治疗作用1) HDACi联合ATRA抑制人宫颈癌组织移植瘤的生长：收集人低分化宫颈鳞癌组织,经过裸鼠皮下2次移植建立移植瘤模型。药物治疗4周后,联合用药显著抑制肿瘤生长(P<0.01),对照组、VPA组、ATRA组和联合用药组肿瘤平均体积分别316.65±94.58mm3,119.83±7.74mm3, and208.64±76.61mm3,66.84±19.10mm3；肿瘤抑制率(percentage of tumor-growth inhibition,%TGI)分别为59.39%,37.58%,和73.33%。2) HDACi联合ATRA诱导移植瘤分化及细胞凋亡：药物治疗4周后,剥离肿瘤组织,HE染色可见联合治疗组出现细胞角化和少量角化珠形成,未见核分裂相,而对照组仍维持来源宫颈癌组织的低分化状态,核分裂相多见。免疫组化显示,HDACi联合ATRA抑制Ki67表达,提高AcH3、RARβ2、及Loricrin、和Involucrin的表达；TUNEL检测显示,VPA治疗后凋亡细胞增加,联合治疗组凋亡细胞增加最为显著(P<0.01)。3) HDACi联合ATRA通过表观遗传调控机制重启RARβ2而发挥抗肿瘤作用：药物治疗4周后,免疫组化和WB结果表明组蛋白H3乙酰化水平显著提高；ChIP结果显示,H3K9ac可以与RARβ2启动子核心区域RARE结合,从而启动RARβ2的表达；与体外实验结果一致,Q-PCR和WB结果显示重启RARβ2表达后,其下游E-cadherin和上皮细胞分化标志物Involucrin和Loricrin的表达显著上调；同时P21CIP1、P53和活化的Caspase3表达上调,Stat3磷酸化水平显著降低,Bcl2的表达出现下调。综上所述,HDACi单独和联合ATRA可以通过表观遗传途径重启宫颈癌细胞RARβ2的表达,继而提供了两者协同／相加抗肿瘤作用的分子基础；HDACi联合ATRA使宫颈癌细胞脱离细胞周期,通过E-cadherin/PI3K/Akt通路诱导细胞分化是其抗肿瘤作用的主要机制,细胞凋亡也发挥了一定作用。本研究不仅进一步完善了宫颈癌的发病机制,而且阐明了HDACi联合ATRA对宫颈癌诱导分化治疗的效果及信号途径,为临床宫颈癌的防治提供了新的策略,但是治疗效果还需要通过临床试验进一步验证和评价。