喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，尽管近年来手术技术有了明显的提高、喉癌化疗、放疗及激光治疗卓有成效，但喉癌总的生存率仍很低，尤其对Ⅲ-Ⅳ期及复发、转移的喉癌疗效不容乐观,仍有30%-40%的患者死于复发或转移。因此人们一直在不断地寻求新的更有效的治疗方式。随着近年来肿瘤和基因治疗基础领域研究的不断突破，肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的机遇。本文的研究目的是利用反义RNA技术靶向封闭凋亡抑制基因Survivin在喉癌细胞Hep-2中的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，同时抑制肿瘤细胞的生长，为喉癌的基因治疗寻找新的靶点，开辟一条新思路。越来越多的研究表明恶性肿瘤的发生发展与细胞凋亡、增殖调节失控密切相关。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族IAP(inhibitor of apoptosis protein)中结构最简单的成员，具有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。它不同于凋亡抑制蛋白家族的其他成员，在正常组织中不表达或低表达，而在人类大多数恶性肿瘤中高表达。现已证实，Survivin在各种类型的肺癌、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肝癌、食道鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、白血病、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤等均有异常表达。Survivin这一独特的组织分布的选择性，使它可能成为肿瘤基因靶向治疗的潜在靶点。也即如能靶向封闭<WP=110>此基因，则可阻断这一抗凋亡途径，只杀伤肿瘤细胞而不伤及正常细胞。反义RNA（anti-sense RNA）是指能够通过碱基互补与目的基因的mRNA特异性结合，抑制靶mRNA的功能，从而调控其表达的一类小分子转录物。近20年来，反义RNA技术不断发展完善，应用反义RNA在调控基因表达、特别是在抑制一些有害的基因表达方面取得了很大进展。与反义寡核苷酸技术相比，反义RNA可以克服反义寡核苷酸基因治疗时细胞对其吸收率低、半衰期短、特异性差、基因传递不完全、对细胞有毒性的缺点。而且，反义RNA技术具有成本较低、作用的长效性等反义寡核苷酸技术无法比拟的优势。本研究的主要内容和成果包括以下几方面：1. 应用免疫组织化学技术检测了42例喉癌组织、20例癌旁组织、20例喉角化症及10例正常喉粘膜中Survivin 蛋白的表达情况，证实了在人喉癌组织中Survivin有较高的表达（66.7%），癌旁组织及喉角化症中Survivin的表达相对较弱(40%、35%)，而在正常喉黏膜中无Survivin表达。这一结果表明，Survivin在喉癌中的异常表达可能与喉癌的发生有关。2. 成功的构建了Survivin反义RNA真核表达载体：根据Genbank中NM-001168 Survivin mRNA 序列应用软件primer 5.0分别针对mRNA大部分编码序列和mRNA3’端非编码区设计了两对引物。1）针对mRNA大部分编码序列 上游引物：5’- GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC- 3’下游引物：5’- AGATCTTTCTTATTGTTGGTTTCC- 3’2）针对mRNA3’端非编码区上游引物： 5’-GAATTCGTCCCTGGCTCCTCTACT-3’ 下游引物：5’ -AGATCTCAAATCCATCATCTTACGC-3’ 根据真核表达载体pEGFP-C1多克隆酶切位点的位置（Bgl II在前，EcoR I<WP=111>在后），设计以上两对引物上游引物5’端均带有EcoR I酶切位点GAATTC，下游引物5’端带有Bgl II 酶切位点AGATCT，以达到将cDNA反向插入载体的目的。 用Trizol提取喉癌细胞中的总RNA，通过RT-PCR技术从喉癌细胞中钓取针对Survivin mRNA大部分编码序列和mRNA3’端非编码区cDNA。首先与过渡载体pMD18-T载体相连，转化感受态细胞扩增质粒，测序正确后Bgl II和EcoR I双酶切pMD18-T载体和pEGFP-C1载体分别获取插入pMD18-T载体的cDNA片段和线性化pEGFP-C1载体，在T4连接酶的作用下将cDNA片段反向插入pEGFP-C1载体，经测序证实碱基序列的正确性，表明反义Survivin RNA真核表达载体构建成功（分别命名为pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2）。实验细胞和细胞培养:人喉癌细胞株Hep-2培养于10%RPMI-1640(含小牛血清)完全培养基，37℃、5%CO2孵箱培养。实验细胞取对数生长期的喉癌细胞，2-3天传代一次。转染Hep-2获稳定细胞株：用真核转染技术成功地将上述两对重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2（将重组质粒与脂质体混合，按试剂操作说明进行），并利用G418（300mg/ml的维持浓度）筛选，获得转染pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2的稳定细胞株（分别命名为HpEGFP/Survivin-1和HpEGFP/Survivin-2），同时将转染空载体pEGFP-C1的稳定细胞株（命名为HpEGFP-C1）作为对照。为后续实验奠定了基础。由于所用的载体pEGFP-C1能编码绿色荧光，因此，可在荧光显微镜下直接观察转染的细胞。4．应用半定量RT-PCR和蛋白免疫印迹Western- blot技术分别从mRNA水平及蛋白水平检测了反义Survivin RNA真核表达载体封闭喉癌细胞Hep-2中Survivin 表达的效果，结果表明，构建的两对反义Survivin载体（pEGFP/Survivin-1和pEGFP/Survivin-2）在Hep-2细胞内分别从mRNA<WP=112>水平及蛋白水平不同程度的抑制了Survivin的表达，抑制率分别为30-40%。 5 . 反义 Survivin载体诱导喉癌细胞凋亡和抑制其增殖的体外实验：5.1反义 Survivin载体诱导喉癌细胞凋亡 :通过吖?