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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的高度接触性传染病。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。PRRSV进入Marc-145细胞的过程是依赖受体进行的,目前已鉴定出在细胞上存在PRRSV的4个受体:硫酸乙酰肝素(heparin sulfate. HS )、唾液酸粘附素(sialoadhesin. Sn)、CD 163分子和波形蛋白Vimtin。HS, Sn和CD 163三者之间的关系大体为:HS主要作用是吸附PRRSV到PAM细胞上,Sn介导PRRSV的内吞。CD 163和波形蛋白可能起协助Sn内吞、PRRSV脱衣壳和将病毒基因组RNA释放到细胞浆的作用。我们的研究团队制备了针对PRRSV GP5抗体的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2),并利用Mab2-5G2从PAM和MA-104细胞中提取出非肌肉肌球蛋白II型重链A蛋白(Nonmuscle myosin heavy chain II-A,NMHC II-A)。随后的研究证实NMHC II-A和NMHC II-B(NMHC II的不同亚类)均与PRRSV感染细胞有关。为了更加深入的研究PRRSV病毒感染细胞的机制,本为以非肌肉肌球蛋白II型重链B(Nonmuscle myosin heavy chain II B,NMHC II B)羧基端为研究对象,进行了以下三部分的实验:第一,为了得到能够特异性识别NMHC II-B的单克隆抗体,根据Marc-145细胞上NMHC II-B羧基端的蛋白质序列,合成多肽,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA筛选阳性克隆;制备腹水并纯化;用间接ELISA方法和IFA检测纯化抗体的特异性。结果表明获得2株能稳定传代并分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系;2株细胞系所产生的抗体能够特异性的与NMHC II-B羧基端蛋白反应而且能够与Marc-145细胞产生特异性的结合。两株单抗的制备及鉴定为以后研究易感细胞上NMHC II-B与PRRSV感染的关系奠定了基础。第二,提取Marc-145细胞的总RNA,用RT-PCR的方法克隆出Marc-145细胞上NMHC II-B羧基端长为804bp的基因PRB,并构建pET-28a-PRB重组质粒。将此质粒转化至Rosetta表达感受态中,用IPTG诱导表达出大小约35KD的蛋白。将该蛋白纯化并免疫Balb/c小鼠,得到特异性的抗体。用IFA方法检测复性的纯化PRB蛋白能够和Marc-145结合;PRRSV与复性的PRB蛋白孵育后再感染Marc-145细胞,其感染能力显著性增强。第三,构建pEGFP-N1-PRB重组质粒,分别转染Marc-145细胞和BHK-21细胞,得到了较高的转染效率,为研究PRB蛋白和PRRSV感染细胞的关系打下了坚实的基础。