研究背景随着人口的日益增多及老龄化社会的到来,白内障导致的视力损伤也越来越多,这一问题已严重影响到人们的健康以及生活质量。目前白内障已成为世界上最主要的致盲性眼病之一,但其发病机制尚不完全清楚。既往研究发现,白内障的发生是由多种因素相互作用导致的,常见的原因包括晶状体氧化损伤、老化变性、晶状体蛋白发生基因突变、辐射损伤、糖的过度刺激、半乳糖代谢障碍以及脂质过氧化损伤等,由于这些因素长期对晶状体的刺激,导致晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)产生不同程度的损伤,最终使晶状体上皮细胞发生凋亡,晶状体从透明转为混浊状态,从而使其功能受到影响,影响光线通过玻璃体到达视网膜的通路,最终导致视物不清、视力下降。年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)以往也称为老年性白内障,这是一种与年龄相关的疾病,也是目前老年人出现视力下降及盲的主要原因。其发生主要是由于随着年龄增长,晶状体受到如上所述一些因素的影响,出现变性混浊。随着我国人口的增长及老龄化,年龄相关性白内障患者人数不断增加。有研究表明,晶状体上皮细胞的凋亡在其发病过程中发挥着重要作用。晶状体赤道部的上皮细胞不断增生分化,从而形成新的晶状体纤维,这些晶状体纤维不断向晶状体的中央区即晶状体核区移动,在这个过程中,晶状体纤维细胞的细胞器和细胞核不断地发生退化,最终消失,只残留透明的细胞质部分,进而形成了晶状体核,这一部分几乎是不存在蛋白质的,随着时间推移,晶状体的硬度较前增加。随着年龄增长,老化是不可避免的,人类无法完全阻止各个器官的老化,包括晶状体的老化,但随着科学的发展,我们正在努力采取一些措施来延缓晶状体的老化。对于年龄相关性白内障,如果能够及早采用外用药物干预,预防晶状体混浊的发生,提早实现维持晶状体透明,减轻年龄相关性白内障的发展程度,更大程度地提高年龄相关性白内障患者的生存质量。目前白内障的治疗方法主要是通过晶状体超声乳化或晶状体囊外摘除术来摘除混浊的晶状体,植入人工晶体,使患者视力得到恢复,但这一技术仍有一定的创伤性；并且传统治疗白内障药物在临床应用上的效果也不十分明显。因此,对年龄相关性白内障的发病机制进行进一步研究,将为年龄相关性白内障的治疗提供新的思路。研究目的为进一步探讨年龄相关性白内障的发病机制,本研究采用miRNA芯片技术筛选人眼年龄相关性白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞中miRNA的表达谱,并对hsa-miRNA-15a调控晶状体上皮细胞凋亡机制进行荧光定量分析及细胞培养过表达检测,进一步阐明年龄相关性白内障与晶状体上皮细胞凋亡的关系,为白内障的基因治疗奠定基础。研究方法本研究分为三部分：第一部分miRNA芯片筛选miRNA在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞及正常晶状体上皮细胞中的表达谱,初步筛选出与年龄相关性白内障发生相关的miRNAs表达谱,为miRNAs参与晶状体上皮细胞凋亡行为的机制提供研究基础。本研究采用miRNAs芯片技术,选取5例年龄相关性白内障晶状体前囊膜及5例正常晶状体前囊膜,检测两种晶状体上皮细胞内miRNAs的表达,筛选出与白内障发生相关且差异大于2倍的miRNAs。第二部分检测hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、 mcl-1在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞及正常晶状体上皮细胞中的表达,研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2. mcl-1在年龄相关性白内障发生过程中的变化,进一步阐明其在白内障发病机制中的作用。本研究选取60例年龄相关性白内障患者,包括皮质性白内障20例、核性白内障20例和后囊下型白内障20例(分别标记为A、B、C组),20例正常晶状体前囊膜上皮细胞做为对照组,采用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)方法检测hsa-miRNA-15a-5p. hsa-miRNA-15a-3p在对照组和三种不同类型年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达；同上述方法,将获取的晶状体前囊膜一半用于Real-time PCR,另一半用于Western blot检测,分别采用这两种方法检测其靶基因bcl-2和mcl-1在对照组和三种不同类型年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达,并进行统计学分析。第三部分培养人晶状体上皮细胞,将hsa-miRNA-15a过表达于人晶状体上皮细胞,检测hsa-miRNA-15a对晶状体上皮细胞凋亡的影响,从而进一步明确其对细胞凋亡产生的作用。选取人晶状体上皮细胞进行培养,分别转染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p,采取Real-time PCR验证其在培养人细胞中的表达量,电镜观察转染细胞形态学改变,通过MTS、平板克隆细胞增殖试验,Hoechst、TUNEL、 AnnexinV-FTTC/PI凋亡检测及细胞划痕实验和Transwell侵袭迁移实验检测细胞功能学的改变。研究结果1.通过对年龄相关性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体细胞样品miRNAs芯片表达谱的结果分析,以上调或下调>2倍为基准,通过筛选,其中有181个miRNAs上调,有114个miRNAs下调。在这些miRNAs中,有126个上调超过5倍；有51个下调超过5倍。2.通过Real-time PCR检测结果显示：hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p、在正常晶状体上皮细胞中有少量表达,而在皮质性、核性及后囊下型白内障晶状体上皮细胞表达量明显增高,在皮质性白内障晶状体上皮细胞中表达水平可达正常晶状体的5-8倍,在核型白内障中达到10倍以上,在后囊下型白内障中甚至可达20倍以上。统计学分析结果显示,hsa-miRNA-15a-5p在皮质性白内障组、核性白内障组、后囊下型白内障组中平均相对表达量与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)；hsa-miRNA-15a-3p在皮质性白内障组、核性白内障组、后囊下型白内障组中平均相对表达量与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。Real-time PCR和Western-blot检测结果均显示：bcl-2和mcl-1在正常晶状体上皮细胞中可见表达,而在皮质性、核性及后囊下型白内障晶状体上皮细胞中表达量明显下调。统计学分析显示,bcl-2在皮质性白内障组、核性白内障组、后囊下型白内障组中平均相对表达量与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)；mcl-1在在皮质性白内障组、核性白内障组、后囊下型白内障组中平均相对表达量与对照组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。3.采用经典的Taqman探针方法,对转染了hsa-miRNA-15a-5p、 hsa-miRNA-15a-3p的人晶状体上皮细胞(Human Lens Epithelial, HLE-B3)进行了定量分析。结果显示在HLE-B3细胞中未检测到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-15a-3p,可能极低甚至不表达这两种miRNA;转染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3细胞中,这两种miRNA表达均有显著提高。细胞形态显示转染了这两种miRNA的细胞,从24h就开始发生改变,细胞变大变圆,轮廓不清,交织的网状结构减少。MTS结果显示转染了这两种miRNA之后,其生长明显受到抑制。hsa-miRN A-15a-3p对HLE-B3生长的最大抑制率达到57.13%, hsa-miRNA-15a-5p对HLE-B3生长的最大抑制率达到44.60%。平板克隆结果显示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p对HLE-B3细胞的克隆形成能力也有明显的抑制作用,TUNEL凋亡检测结果显示：转染了这两种miRNA的HLE-B3细胞检测到明显的绿色荧光,说明这两种miRNA诱发了HLE-B3细胞的凋亡。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测显示转染后的HLE-B3细胞,其细胞碎片明显多于对照组；划痕实验结果显示转染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3细胞的水平迁移能力受到明显抑制,而转染hsa-miRNA-15a-3p的细胞没有影响。结论1.年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中niRNAs表达谱与正常晶状体上皮细胞表达谱有差异,差异表达的miRNAs可能参与了年龄相关性白内障的发生。2. hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三种不同类型的年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中表达均较正常晶状体上皮细胞表达升高；而bcl-2和mcl-1均较正常晶状体上皮细胞表达降低o hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通过抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表达促使细胞凋亡,导致年龄相关性白内障发生。3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p转染人晶状体上皮细胞后抑制细胞增殖及克隆,促使晶状体上皮细胞发生调亡,从而启动了年龄相关性白内障的发生。