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猪流行性腹泻（porcineepidemic diarrhea，PED）是由尼多目（Nidovirales)冠状病毒科（Coronaviridae family）冠状病毒属（Coronaviridae genus）α-冠状病毒中的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病。自2010年冬季以来，由PEDV引起的猪流行性腹泻疫病在全国大部分养猪省份暴发和流行，给我国养猪业造成了巨大经济损失。有研究表明PED流行毒株是不同与以往经典毒株的变异株，但对于其抗原性、致病性及对该病的快速鉴别诊断方法等方面还未见相关全面系统的研究。为了研究河南省PEDV的分子变异情况、细胞培养特性及特异、快速的鉴别诊断方法，该研究选择本实验室已建立的RT-PCR方法检测出的具有代表性的PEDV阳性样品，对其S1基因进行序列测定和遗传进化分析；利用细胞培养技术在Vero细胞、ST细胞和PK-15细胞中摸索PEDV培养条件，分别在这3种细胞中进行了PEDV细胞增殖所需的胰酶浓度、接种时间及接种剂量的试验，筛选出最适宜PEDV细胞增殖的条件；大量比对GenBank中PEDV M基因序列，选取高度保守且具有型特异性基因序列为模板，设计1对PEDV特异性引物和1条TaqMan MGB探针，分别以含有PEDV M基因的pQE30/PEDV重组质粒为模板，采用矩阵法筛选最佳引物和探针浓度，优化最佳酶浓度和退火温度，建立了PEDV实时荧光定量PCR（fluorescentquantitative real-time PCR, FQ-PCR）检测方法，并对该方法进行灵敏性、敏感性、特异性和重复性试验，同时与已有的PEDV RT-PCR方法及基因测序鉴定方法进行符合性比较。结果：16株PEDV S1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.9%～99.8%和97.0%～99.6%，与2011年以来国内登录的PEDV基因Ⅲ群流行株核苷酸同源性为97.7%～99.5%，氨基酸同源性为97.7%～99.0%；与2011年国内登录的PEDV基因Ⅰ群流行毒株的核苷酸同源性为89.9%～90.5%，氨基酸同源性为89.7%～91.1%；与2012年国内登录PEDV流行株核苷酸同源性为98.1%～99.7%，氨基酸同源性为97.3%～99.6%；与2013年国内登录的PEDV流行株核苷酸同源性为97.2%～99.3%，氨基酸同源性为95.7%～99.6%；与经典毒株CV777核苷酸同源性为92.5%～92.9%，氨基酸同源性为90.5%～91.4%。16株S1基因均存在相同的插入和缺失，与2011年以来国内登录的基因Ⅲ群流行株相比没有大的变异，但与毒株CV777相比较，在第163～166bp处有3个核苷酸插入，在173～174bp之间有9个核苷酸插入，在405～406bp之间有3个核苷酸插入，在463～464bp之间有3个核苷酸缺失，这些位点核苷酸的插入和缺失导致了其编码的氨基酸相应改变；系统进化树分析表明，河南省16株与2011年以来国内登录的大部分流行变异毒株均属于基因Ⅲ群，而经典毒株CV777所在分枝群属于基因Ⅱ群。PEDV阳性样品能在Vero细胞中成功增殖至第9代，并能出现典型的细胞病变现象。增殖病毒用细胞培养液中的最适胰酶浓度为5μg/mL，适合接种的最适接种时间为细胞生长至32h时，接种的最适剂量为100μL/mL；但PEDV阳性样品在ST和PK-15细胞中未增殖成功。成功建立了PEDV TaqMan MGB FQ-PCR检测方法，其标准曲线的循环阈值（Ct）与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.999，拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式为Ct=-3.12×log X+41.67；该方法灵敏度可达101copies/μL，可特异性的检测出PEDV阳性样品，而对猪瘟病毒（HCV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒（PoRV）以及鸡、鸭、牛等其他病毒共93份已知非PEDV样品及阴性对照均呈现阴性；不同浓度的PEDV重组质粒分别重复扩增3次，重复结果良好；与基因测序鉴定的符合率100%，与RT-PCR方法的符合率为88.7%。本研究结果表明适合PEDV体外增殖的细胞为Vero细胞，且胰酶浓度、接种时间、接种剂量及细胞生长状态都将影响其在细胞培养中增殖情况；S1基因系统进化树分析表明2011年以来，我国流行的PEDV毒株中同时有基因Ⅲ群和Ⅰ群的存在，但河南流行毒株以基因Ⅲ群为主，其致病性和抗原性差异仍有待进一步研究；成功建立的灵敏、快速、特异的FQ-PCR检测方法将为PEDV的快速鉴别诊断提供可靠的技术保障。