论文部分内容阅读
第一部分:LncRNA H19在HIBD新生大鼠心肌组织中的表达及功能研究目的分析长链非编码（long non-coding）RNA（LncRNA）H19在缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）新生大鼠心肌中的表达情况及功能。方法挑选7日龄健康CD（SD）IGS大鼠,采用随机分组的方式划分为假手术（sham）组、手术（HIBD）组、手术组+注射H19的慢病毒过表达载体（HIBD+Lv-H19）组、手术组+空载病毒（HIBD+Lv-NC）组。采用结扎颈总动脉后进行缺氧的方法,建立HIBD模型。缺氧缺血（hypoxia-ischemia,HI）术后24h通过TTC法检测sham组和HIBD组新生大鼠脑梗死体积;采用TUNEL染色检测sham组和HIBD组术后2h,12h,24h,48h,72h and 120h心肌组织的凋亡情况;q RT-PCR检测心肌组织上述时间点LncRNA H19的表达水平。术前48h给HIBD+Lv-H19组和HIBD+Lv-NC组新生大鼠尾静脉分别注射Lv-H19和空载病毒,TUNEL检测sham组、HIBD组、HIBD+Lv-H19组和HIBD+Lv-NC组术后48h心肌组织细胞凋亡情况以及采用Western blot检测抗凋亡蛋白B-cell lymphoma-2（Bcl-2）、促凋亡蛋白Bcl-2-associated X（Bax）和Caspase 3（cleaved）的表达水平;采用酶联免疫试剂盒检测了心肌组织中炎症因子表达情况,包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的表达水平;采用氧化应激检测试剂盒检测氧化应激相关蛋白丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达水平。结果1.与sham组相比,HIBD组新生大鼠手HI术后24h右侧（术侧）脑梗死体积显著增加（P＜0.001）,表明HIBD新生大鼠模型构建成功。与sham组相比,HIBD组实验大鼠各个时间点心肌细胞凋亡指数均显著升高（均P＜0.05）,而心肌组织中LncRNA H19表达量在各个时间点均显著降低（均P＜0.05）。2.与HIBD+Lv-NC组相比,HIBD+Lv-H19组大鼠尾静脉注射Lv-H19后,在术后48h时心肌组织H19表达水平显著上升（P＜0.05）,而心肌细胞凋亡指数显著下降（P＜0.05）;相比于sham组,促凋亡蛋白Caspase-3（cleaved）以及Bax在HIBD组大鼠心肌组织中显著上升（P＜0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降（P＜0.05）;而过表达H19后,凋亡相关蛋白水平与前者呈现相反的趋势（P＜0.05）。3.与HIBD+Lv-NC组相比,过表达H19后的HIBD+Lv-H19组大鼠心肌组织TNF-α,IL-1β和IL-6表达水平显著降低（均P＜0.05）;MDA显著下降（P＜0.05）,SOD和GSH-Px活力则显著上升（均P＜0.05）。结论LncRNA H19在HIBD模型新生大鼠心肌组织中表达下调,过表达H19可抑制HIBD新生大鼠心肌细胞凋亡、减轻HIBD新生大鼠心肌组织的炎症水平和氧化应激。第二部分LncRNA H19竞争性结合miR-149-5p上调LIF表达目的验证LncRNA H19与miR-149-5p、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）之间的靶向关系。方法生物信息学在线网站通过Star Base预测LncRNA H19/miR-149-5p,miR-149-5p/LIF相互关系,并采用HEK293T细胞转染miR-149-5p增强剂（miR-149-5p mimics）和空载对照（NC-mimics）,利用双荧光素酶基因报告实验验证其靶向关系。动物分组同前:sham组、HIBD组、HIBD+Lv-H19组、HIBD+Lv-N组,q RT-PCR检测miR-149-5p和LIF的表达水平,Western blot检测LIF蛋白的表达水平。结果1.细胞实验结果表明,LncRNA H19和miR-149-5p存在结合关系,与NC-mimics相比,miR-149-5p mimic处理的野生型（Wild-type,wt）H19（H19-wt）荧光强度显著下降（P＜0.05）,而突变型H19（H19-mut）荧光强度无显著差异。与此同时,与NC-mimics相比,miR-149-5p mimic处理的LIF-wt荧光强度显著下降（P＜0.05）,而突变型LIF（LIF-mut）荧光强度无显著差异。2.动物实验结果表明,与sham组相比,HIBD组新生大鼠心肌组织中miR-149-5p的表达水平显著增加（P＜0.05）,而LIF m RNA和蛋白均显著降低（P＜0.05）。相反,与HIBD+Lv-NC组相比,H19过表达后的HIBD+Lv-H19组大鼠心肌组织的miR-149-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）,而LIF m RNA和蛋白均显著增加（均P＜0.05）。结论LncRNA H19通过竞争性结合miR-149-5p上调LIF表达。第三部分LncRNA H19通过激活PI3K/AKT信号通路调控HIBD新生大鼠心肌细胞凋亡目的探讨LncRNA H19通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）通路在HIBD新生大鼠心肌细胞凋亡中的影响及机制。方法首先将动物分组为sham组、HIBD组、HIBD+Lv-H19组、HIBD+Lv-NC组;Western blot检测PI3K/AKT信号通路关键蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表达水平。其次,将动物分为HIBD+Lv-H19+生理盐水组（对照组）和HIBD+Lv-H19+Wortmannin组（干预组）。Wortmannin（PI3K/AKT通路抑制剂）剂量为15μg/kg,HIBD后经尾静脉注射。Western blot检测p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT及Bcl-2、Bax和Caspase 3（cleaved）的表达水平;TUNEL检测心肌组织细胞凋亡情况。结果1.相比于sham组,HIBD组的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著减少（P＜0.01）;与HIBD+Lv-NC组相比,过表达H19的HIBD+Lv-H19组新生大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著增加（P＜0.01）。2.与生理盐水注射对照组相比,Wortmannin注射后,HIBD+Lv-H19组心肌组织p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著降低（P＜0.05）;促凋亡蛋白Caspase-3（cleaved）以及Bax在大鼠心肌组织中显著上升,而抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降（均P＜0.05）;TUNEL染色显示细胞凋亡指数显著升高（P＜0.05）。结论LncRNA H19通过PI3K/AKT通路抑制HIBD新生大鼠心肌细胞凋亡。