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锰氧化物在元素生物地球化学循环过程中起着重要作用,而不同种类的细菌对Mn(Ⅱ)的氧化作用是自然界中氧化锰矿物形成的主要成因。本文从山东崅峪棕壤中分离得到一株高锰氧化活性的大肠杆菌(Escherichia coli),并针对该菌株进行了转座突变文库的构建及锰氧化相关基因的研究。 从山东崅峪采集的棕壤中分离得到1株具有高锰氧化活性(65μmol/L)的土壤杆菌,通过对该菌株形态学特征的观察和生理生化特征的测定,并结合G+Cmol%测定和16S rRNA基因序列测定与系统进化分析将其鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli),命名为MB266。进一步从分离菌株MB266中扩增得到了编码多铜氧化酶的基因mco,并对其进行了测序与基因结构分析(GenBank登录号:JF682492),发现该基因编码的MCO蛋白与已报道的大肠杆菌Ⅲ型多铜氧化酶的氨基酸相似度达99%,而与已报道的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)模式菌株MnB1中推断与锰氧化有关的基因cumA编码的蛋白质的氨基酸序列仅有19.2%的相似性,但MCO与CumA的一级结构中都存在有2个保守的铜离子结合位点,且它们在二级结构上都存在由多个β-折叠片形成的两个β-桶结构域,由此可以推断二者对Mn(Ⅱ)的氧化作用可能与这些结构上的共性有关。这是目前首次关于大肠杆菌野生菌株具有锰氧化活性的研究。 通过双亲本滤膜接合转座的方法构建了MB266菌株的转座突变文库。利用含卡那霉素抗性基因的pUTmini-Tn5Km2的转座载体将卡那霉素抗性基因(kan)随机插入锰氧化活性菌株MB266基因组中,以相应的抗生素进行筛选,获得了在不同位点插入突变的突变株518株,并从中筛选无锰氧化活性的突变株3株。通过Realtime-qPCR的方法对野生菌株MB266和突变株MB521的31组可能的与锰氧化活性相关的基因的转录活性进行了比较分析,结果发现在锰胁迫条件下,2个与鞭毛相关的基因fliH和fliI,以及1个双组份调控系统相关的基因citB在突变株中表现为明显的转录下调,而基因fliH转录下调最为显著。 利用反向PCR的方法进行插入位点序列的扩增与测序分析。突变株MB521经反向PCR的方法扩增得到插入位点片段并经测序后,与GenBank数据库中的基因进行序列比对分析,结果显示与大肠杆菌K12中一种推测的与DNA结合的转录调控因子yihL的相似性最高达81%,将测序的基因命名为MB-yihL。yihL是一种推测的与DNA结合的转录调控因子,包含一个HTH gntR类型的DNA结合域,功能尚不清楚,推测转录调控因子MB-yihL的中断可能导致锰氧化相关基因的转录调控受到抑制,从而影响菌株对锰的氧化作用。