目的为了研究红景天预给药对缺氧脑损伤的保护作用,以及对脑组织线粒体形态、功能的影响,特别是对线粒体MPTP的作用,本研究从整体动物、离体细胞两个水平上,通过建立小鼠缺氧脑损伤模型和复制PC12细胞缺氧模型,采用生化及病理检测,以及流式细胞术、Western Blot、电化学等分子、生物学技术,同时通过检测线粒体结构、膜电位、呼吸功能、Ca²⁺释放、Bcl-2、Caspase 3活性等变化,以期从对线粒体影响的层面阐明红景天抗缺氧脑保护的作用机制。方法第一部分:红景天预给药对小鼠缺氧脑损伤神经保护作用及线粒体MPTP影响1.小鼠缺氧脑损伤造模使用“低压低氧动物实验舱”模拟高原缺氧环境,通过设置不同的高度和时间,对BALB/c小鼠进行缺氧损伤。通过观察小鼠缺氧中的一般状态,记录缺氧后存活率,检测缺氧后LDH、LD、SOD、MDA指标变化,结合小鼠缺氧后脑海马CA1区病理观察结果,确定小鼠缺氧脑损伤造模方案。2.将小鼠随机分为正常对照组、缺氧组（密闭缺氧实验不设）、缺氧预适应组、盐酸氟桂利嗪组、红景天口服液组、红景天低、中、高剂量组,采用密闭缺氧存活实验、MWM水迷宫实验,通过测试红景天预给药对小鼠缺氧耐受能力的影响,以及对缺氧脑损伤后学习记忆能力的保护作用,评价红景天的抗缺氧药效;3.参考前述分组,在小鼠缺氧脑损伤后即刻分离脑组织,制作小鼠脑病理切片,采用TUNEL染色观察缺氧海马CA1区神经元凋亡情况;通过分离缺氧脑组织海马,制作超薄切片,在透射电镜下观察海马神经细胞线粒体形态变化。利用病理方法,从细胞形态层面观察红景天对缺氧脑损伤小鼠脑神经细胞的保护作用;4.参照前述分组,小鼠缺氧脑损伤后即刻取脑并抽提线粒体,对线粒体呼吸功能（ST3、ST4、RCR）、MPTP通透性、MMP进行测试,从线粒体功能角度探讨红景天对缺氧脑损伤小鼠脑组织线粒体的保护作用,并分析红景天抗缺氧脑保护作用的线粒体MPTP机制。第二部分:红景天苷预处理对PC12细胞的缺氧保护作用及线粒体MPTP影响1.选择生长良好处于对数生长期的PC12细胞,按细胞数量加入适量生长液制成细胞悬液,将浓度分别为:5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、60μM、80μM待测红景天苷用细胞培养液,分别加入细胞培养板中,利用MTT确定细胞活力,根据对比DO值计算红景天苷ID50,确定红景天苷预处理的剂量,并设置低、中、高三种不同的预处理剂量;2.将PC12细胞分为对照组,缺氧组,缺氧预适应组,低、中、高剂量红景天预处理组共6个组,并结合MPTP阻断剂CsA和激动剂ATR干预,通过MTT、LDH释放率检测红景天苷预处理对缺氧诱导PC12细胞的影响,评价红景天对缺氧细胞抗缺氧效果,并分析与线粒体MPTP的关系;3.将PC12细胞分为对照组,缺氧组,缺氧预适应组,低、中、高剂量红景天预处理组共6个组,并结合MPTP阻断剂CsA和激动剂ATR干预,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western Blot分析Bcl-2表达,并检测细胞Caspase 3活性,分析红景天苷预处理对缺氧诱导PC12细胞凋亡及相关因素的影响;4.参照前述分组,采用TMRE法检测线粒体膜电位变化情况,并利用荧光光度法检测线粒体Ca²⁺浓度,观察红景天苷预处理对缺氧PC12细胞线粒体MPTP功能的影响。结果第一部分:红景天预给药对小鼠缺氧脑损伤神经保护作用及线粒体MPTP影响1.不同缺氧高度及时间条件下,各组小鼠的状态表现,小鼠的死亡率,LDH、SOD、LD、MDA变化情况,以及脑海马HE染色结果均不相同。其中10000m高度缺氧1h死亡率即达到50%,随着缺氧时间的延长,死亡率逐渐增高至100%,因此10000m高度死亡率过高不适宜造模,而各组生化指标及HE结果显示8000m高度,缺氧12h、18h脑损伤更明显,因此将小鼠缺氧脑损伤造模方案确定为8000m高度缺氧18h;2.红景天预给药能够明显提高小鼠密闭缺氧存活时间（P<0.05）;而通过定位巡航及空间探索能力检测发现,缺氧后小鼠记忆、学习能力明显下降,而高、中、低剂量的红景天水煎剂、以及成品药物“红景天口服液”均具有减轻小鼠缺氧的脑损伤作用,说明红景天具有较好的抗缺氧功效。3.TUNEL检测结果显示,对照组小鼠脑组织CA1区神经元细胞凋亡比率很少,缺氧组小鼠脑组织中CA1区凋亡细胞数量明显升高（P<0.01）,不同浓度红景天干预组其凋亡细胞数较缺氧组均具明显减少（P<0.05）。电镜观察线粒体形态变化显示,对照组小鼠脑神经元细胞的胞核核膜清楚,核内染色质密度分布平均,胞浆内线粒体数量较多,形态正常,分布均一。缺氧组小鼠脑神经元细胞核出现不规则固缩,异染色质边集化,线粒体体积增大,嵴断裂或消失。红景天低剂量、高剂量组细胞核出现固缩,部分线粒体肿胀,部分线粒体嵴断裂或模糊。缺氧预适应组、红景天口服液组、红景天中剂量组细胞核染色质均一,线粒体形态正常,分布正常,但偶见染色质边集。以上结果说明缺氧预适应、红景天口服液及红景天均能降低缺氧小鼠脑神经元细胞的凋亡,并能在不同程度上降低缺氧造成的小鼠脑神经元细胞线粒体结构性破坏,提示红景天能够降低缺氧损伤脑细胞凋亡率,并可能与保护线粒体结构有关。4.小鼠脑神经元线粒体呼吸功能检测结果显示缺氧能够明显降低神经元线粒体中ST3的含量（P<0.01）;而各红景天预处理组（红景天口服液及红景天不同剂量组）ST3的水平均明显高于缺氧组（P<0.01）。ST4的表达在缺氧组中明显升高（P<0.01）,而不同浓度的红景天、红景天口服液组ST4的含量均较低（P<0.01）;线粒体膜通透性检测结果显示,各组在加入Ca²⁺作用后OD值均呈下降趋势,缺氧组OD值的下降幅度明显高于对照组（P<0.01）,而其余各预处理组OD值下降幅度均明显低于缺氧组（P<0.01）;线粒体膜电位（MMP）检测结果显示,缺氧组小鼠线粒体MMP改变最为明显（P<0.01）,并明显高于其它组,各预处理组线粒体MMP变化均明显低于缺氧组（P<0.01）。以上结果提示,缺氧会损害脑神经元线粒体呼吸功能,促使线粒体MPTP通透性升高,引起线粒体膜电位改变,而红景天预给药能够减轻缺氧引起的以上病变,起到保护缺氧脑损伤神经元线粒体功能的作用。第二部分:红景天苷预处理对PC12细胞的缺氧保护作用及线粒体MPTP影响1.根据不同浓度红景天苷预处理的细胞在MTT干预后的存活率推算出ID50值约为32.17μM,并将低、中、高剂量红景天苷预处理浓度分别设置为5μM、10μM、15μM。2.PC12细胞活力及LDH释放率检测结果显示,不同浓度的红景天苷干预处理后,明显上调细胞活力（P<0.01）,加入MPTP阻断剂CsA后,细胞活力明显升高（P<0.01）,加入MPTP的激动剂ATR后,细胞活力进一步下调（P<0.01）,提示红景天苷预处理对缺氧细胞具有保护作用,并与MPTP有关。3.凋亡相关检测结果显示,缺氧能够极显著增加PC12细胞凋亡比率（P<0.01）,不同浓度的红景天苷预处理均能明显降低凋亡细胞所占比率（P<0.01）。ATR能够进一步显著升高各组凋亡细胞所占比率,CsA能够降低各组细胞所占比率;Caspase 3活性测试结果显示,缺氧组Caspase 3活性极明显升高（P<0.01）,而相对于缺氧组,不同浓度的红景天苷组均能降低Caspase 3的活性,但活性均仍高于对照组。而MPTP阻断剂CsA能够进一步抑制Caspase 3的活性;MPTP激动剂ATR能够上调Caspase 3的活性;Bcl-2表达测试结果显示,缺氧组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显升高,缺氧预适应组中Bcl-2的表达量升高最明显,不同浓度的红景天苷组均能极显著的升高Bcl-2的表达量。以上结果说明,红景天预干预能降低缺氧PC12细胞凋亡率,且与Bcl-2、Caspase 3通路有关;4.线粒体MPTP功能测试结果显示,缺氧时PC12细胞线粒体MMP下降,而红景天苷及CsA均能减小缺氧时PC12细胞线粒体MMP的下降,ATR能够上调线粒体膜电位。线粒体Ca²⁺浓度测试结果显示,缺氧组细胞内Ca²⁺浓度极显著高于对照组;MPTP阻断剂CsA能够降低细胞内Ca²⁺浓度;MPTP激动剂ATR能够升高细胞内Ca²⁺浓度;红景天苷各剂量组有效的抑制了细胞Ca²⁺浓度的升高,并呈现一定的剂量依赖性。说明,红景天预干预具有保护缺氧PC12细胞线粒体MPTP的作用。结论缺氧会引起小鼠脑组织生理、生化改变,脑细胞结构明显破坏,学习记忆功能明显受损,线粒体结构和功能也明显受损;而红景天预给药及缺氧“预适应”,均能够抑制缺氧对小鼠脑的损害。而且,红景天预给药对缺氧脑损伤的保护作用,主要是通过抑制脑细胞线粒体膜转运孔MPTP的开放,阻止线粒体膜电位变化及线粒体膜内外Ca²⁺离子浓度的差别,升高Bcl-2表达,降低caspase3表达,抑制神经元细胞凋亡的发生来抵抗缺氧损伤,该保护机制与缺氧“预适应”对缺氧脑损伤的线粒体保护机制类似。