非生物胁迫严重影响了植物的生长和作物产量,对农业生产造成巨大威胁。植物在长期的进化过程中,发展形成了一系列的分子、细胞和生理生化机制,以抵御、适应各种逆境。逆境相关基因的克隆和功能鉴定已成为研究热点。胁迫相关蛋白(Stress Associated Protein,SAP)是一类含有特异性的A20/AN1锌指结构域的蛋白家族。在拟南芥和水稻中,SAP蛋白主要参与干旱、高盐、ABA等胁迫应答反应。本研究对高粱SAP基因家族进行了生物信息学分析,在此基础上进一步克隆SbSAP14基因及其启动子,并对它们的功能进行了研究。主要取得了以下结果:　　 1、高粱SAP基因家族生物信息学分析:该家族共有15个成员,其中3个成员(SbSAP1-3)含有内含子,另外12个(SbSAP4-15)没有内含子。根据高粱SAP基因的蛋白保守性把15个高粱SAP基因分成了Ⅰ、Ⅱ两个亚家族。预测所有SbSAP蛋白均不具有信号肽。跨膜结构域预测发现,SbSAP12可能具有2个跨膜结构,SbSAP1、3、8、9、10、15等6个蛋白各有1个跨膜结构。亚细胞定位预测发现,SbSAP1、3、8、12等4个蛋白可能定位于细胞质;SbSAP2、4、15等3个蛋白可能定位于叶绿体;SbSAP7、10、11、13、14等5个蛋白可能定位于细胞核;SbSAP9可能定位于线粒体;而SbSAP6则可能是胞外蛋白质。　　 2、基因克隆及基因表达分析:利用RT-PCR方法从高粱中克隆到一个含有A20和AN1锌指结构的SbSAP14基因,与水稻的OsSAP14具有较高同源性。胁迫处理后进行基因表达分析的实验结果表明,SbSAP14基因的表达受到干旱、高盐、氧化等非生物胁迫的诱导,另外还受到植物胁迫激素脱落酸(ABA)的诱导,但不受冷冻胁迫和水杨酸(SA)的诱导。　　 3、亚细胞定位分析:采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的pBEGFP载体与SbSAP14基因构建成融合表达载体并转化拟南芥进行亚细胞定位。证明SbSAP14蛋白定位于细胞质中。　　 4、转基因水稻的获得及分子鉴定:利用农杆菌介导法将SbSAP14基因导入野生型水稻日本晴(Oryza sativa L.)中;通过PCR和Southern杂交等分子鉴定证明SbSAP14成功插入水稻基因组中;RT-PCR实验结果证明SbSAP14在转基因水稻植株中稳定表达。　　 5、转基因水稻抗盐性分析:在盐胁迫的早期阶段,与3个转基因株系(#1、#4和#27)相比,野生型的叶尖明显变黄萎蔫。细胞膜离子渗透率、丙二醛(MDA)和叶绿素含量测定结果表明,转基因水稻对由盐胁迫引起的氧化损伤的耐受力明显增强。在盐胁迫下,转基因水稻的存活率和种子萌发率均明显高于野生型。更重要的是,活性氧(ROS)的活体染色和原位染色的结果均证实,转基因水稻中ROS的含量明显低于野生型。半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR的结果进一步证实,在转基因水稻中,受ABA诱导的抗盐基因SalT以及APX2、CatB、CatC和SodA(1)等抗氧化胁迫基因的表达水平明显高于野生型中。以上结果表明:SbSAP14转基因水稻通过清除ROS,减少氧化损伤,增加了对盐胁迫的耐受性;另外,SbSAP14还可以通过诱导SalT的表达,增加植物的抗盐能力。在此基础上,初步推测并勾画出SbSAP14作用的模式。　　 6、启动子克隆及瞬时表达分析:克隆、获得了SbSAP14基因的启动子序列,分析发现了一些与干旱、高盐、ABA及其它胁迫相关的顺式作用元件。将SbSAP14基因启动子在水稻愈伤组织中瞬时表达,结果显示,未受胁迫的转基因愈伤组织均不能染成蓝色;经各种胁迫处理后,只有转化pSbSAP14 C::GUS、pSbSAP14D::GUS的愈伤组织有部分染上淡蓝色。说明SbSAP14基因启动子是一个胁迫诱导型的启动子,在-337bp～-913bp区段含有逆境胁迫响应元件。