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研究目的大量研究表明,中医药在治疗慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Viral Hepatitis B,CHB)方面有着独特优势。补肾清毒法源于中医伏气理论“肾虚疫毒内伏肝血”。通过检测补肾清毒法治疗CHB患者前后外周血HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的数量和功能,探讨补肾清毒法对CHB患者外周血特异性CTL的影响,部分阐明补肾清毒法抗HBV可能的作用靶点和免疫活化机制,探析慢性乙型肝炎肾虚邪伏理论的现代科学内涵,为补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎提供较为全面的科学依据。研究方法1.收集广州中医药大学第一附属医院门诊随访的CHB患者,应用HLA-A2作为过筛指标,经流式细胞术直接荧光免疫法筛选HLA-A2阳性CHB患者共32例,所有入选的HLA-A2阳性CHB患者随机分为西药组15例和中西药组17例。另设10例HLA-A2阳性健康献血者为正常对照组。西药组予拉米夫定治疗,中西药组在拉米夫定治疗基础上加用补肾清毒法。2.采集正常组、中西药组、西药组入组时和治疗6个月后外周静脉血20ml,用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC),并冻存于液氮中。3.细胞复苏培养后,采用MHC I-五聚体(Pentamer)染色流式检测技术直接检测HBcAg18-27表位特异性CTL的细胞数量。4.细胞复苏培养后,采用MHC I-五聚体(Pentamer)结合胞内细胞因子(ICS)染色流式检测技术,检测HBcAg18-27表位特异性CTL细胞毒效应分子穿孔素(Perforin)、颗粒酶B (Granzyme B)和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的表达。5.细胞复苏培养后,采用酶联免疫吸附斑点试验(Enzyme Linked Immunologic Spot Assay, ELISPOT)技术测定经HBcAg18-27I肽段诱导特异性CTL分泌IFN-γ的应答频率和平均反应强度。研究结果1.补肾清毒法对外周血HBcAg18-27表位特异性CTL细胞数量的影响治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞的频率(Pentamer+细胞数占CD3+CD8+双阳性细胞总数比例)较正常组高(P<0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞的频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞的频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。2.补肾清毒法对外周血HBcAg18-27表位特异性CTL细胞功能的影响(1) Pentamer结合ICS染色流式检测细胞毒效应分子Perfori、Granzyme B和细胞因子IFN-γ的表达Perforin:治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞Perforin表达频率(Pentamer+Perforin+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)较正常组高(P<0.05),但两治疗组总体频率偏低；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞Perforin表达的频率上升,差异有统计学意义(P<0.05),但总体表达频率仍偏低;‘治疗后,西药组和中西药组特异性CTL细胞Perforin的表达频率相近,差异无统计学意义。Granzyme B:治疗前,中西药组、西药组和正常组特异性CTL细胞Granzyme B表达频率(Pentamer+Granzyme B+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)均偏低；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞Granzyme B表达的频率上升,差异有统计学意义(P<0.05),但总体表达频率仍偏低；治疗后,西药组和中西药组特异性CTL细胞Granzyme B的表达频率相近,差异无统计学意义。IFN-γ:治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率(Pentamer+IFN-γ+细胞数占CD3+CD8+细胞总数的比例)较正常组高(P<0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞IFN-γ的表达频率较高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) ELISPOT法测定经HBcAg18-27I肽诱导特异性CTL分泌IFN-γ的应答频率和平均反应强度治疗前,中西药组和西药组特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的应答频率和平均反应强度较低,两组间差异比较无统计学意义(P>0.05)；与治疗前相比,中西药组和西药组治疗后特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的的应答频率和平均反应强度有所上升,但差异均无统计学意义(P>0.05)；和西药组相比,中西药组特异性CTL细胞对HBcAg18-27I表位肽的的应答频率和平均反应强度均较高,但差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.治疗前,中西药组和西药组CHB患者特异性CTL细胞的数量和表达细胞因子水平偏低,我们认为,这与CHB患者特异性CTL免疫功能障碍有关。正常健康人群特异性CTL水平也较低,这可能由于健康人循环血中不存在HBV特异性抗原的持续刺激,导致HBV特异性CTL水平偏低。2.补肾清毒法治疗后CHB患者外周血特异性CTL细胞数量明显上升。Perforin、 Granzyme B虽有上升,但总体表达频率仍偏低,而IFN-γ则总体表达频率升高明显,表明HBV特异性CTL的非胞毒途径可能在清除病毒中发挥更重要作用。补肾清毒法通过增加特异性CTL细胞数量和改善活化CTL分泌IFN-γ的能力使特异性T细胞免疫功能增强。3. Perforn、Granzyme B、IFN-γ在Pentamer-CD3+CD8+细胞群中表达水平也较高,我们认为,补肾清毒法对非特异性CTL或非HBcAg18-27表位的特异性CTL也有一定程度的影响。补肾清毒法可能通过多靶点、多环节影响免疫系统中多种免疫细胞及细胞因子,发挥免疫调节作用。