目的:棉花枯萎病是影响我国棉花产量和品质的最重要病害之一,挖掘抗病相关基因是利用转基因技术培育棉花抗枯萎病品种的基础。植物转录因子在抗病信号途径中起着重要作用,其中WRKY转录因子在植物抗病中必不可少的。本实验是从陆地棉抗病材料中克隆棉花抗枯萎病相关WRKY转录因子基因Gh WRKY48,分析该基因的表达特性,并初步研究其功能,为棉花抗枯萎病分子育种提供基因资源。方法:本实验以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针,通过电子克隆技术从高抗枯萎病的陆地棉中克隆WRKY转录因子基因Gh WRKY48。通过实时荧光定量PCR分析Gh WRKY48基因在枯萎病菌、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)胁迫下的表达方式;利用VIGS沉默技术初步研究该基因功能。结果:1、从抗病棉花品种“中棉所12”号根部c DNA中克隆得到一个抗枯萎病相关的WRKY转录因子。通过多序列比对分析该基因属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族,将其命名为Gh WRKY48。序列分析发现,该基因c DNA全长为1074个核苷酸,编码了357个氨基酸,含有1个WRKY结构域及1个C2H2型锌指结构。2、对Gh WRKY48基因进行生物信息学分析,其中在编码的蛋白质理化性质分析中发现,编码蛋白分子量为3.94k D,脂肪指数为56.86,等电点6.20,属于疏水蛋白。蛋白二级结构包括延伸链、α螺旋和无规则卷曲。对Gh WRKY48的蛋白磷酸化位点进行预测,发现主要包括三种磷酸位点:分别是苏氨酸(Threonine)(7个)、丝氨酸(Serine)(18个)和络氨酸(Tyrosine)(23个)。3、q RT-PCR分析发现,枯萎病菌处理后,Gh WRKY48的表达量都显著低于对照组。分别用JA、SA、ET处理抗病品种‘中棉所12号’,发现SA和JA均能诱导Gh WRKY48基因表达。SA处理后,Gh WRKY48的表达量显著低于水处理的对照;JA处理后发现,Gh WRKY48的相对表达量明显高于SA处理,呈先增加后降低的变化趋势,在处理后的3h,其表达量显著低于水处理的对照,而在其它时间点,该基因的相对表达量均低于对照组Mock,但差异不显著。ET处理后,该基因的相对表达量变化不明显。4、利用非保守区段构建Gh WRKY48基因的干扰片段TRV2-Gh WRKY48-CO,q RT-PCR检测,沉默效率约为70左右%,表型观察和恢复培养结果显示,沉默了Gh WRKY48基因的棉花和空载相比对枯萎病菌更敏感,沉默棉株的萎蔫程度、发病株数和病情指数均高于对照植株。通过对相关酶的活性分析,发现,沉默植株的CAT、PPO、POD和PAL的酶活性均显著低于空载植株。结论:克隆获得的Gh WRKY48基因,利用实时荧光定量PCR技术证明该基因对枯萎病、水杨酸、茉莉酸均有一定的响应,通过VIGS技术干扰Gh WRKY48基因表达,结果表明Gh WRKY48基因参与了棉花抗枯萎病反应。