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研究背景缺血性心脏病在全球致死性疾病中居于首位,且发病率逐年上升,对缺血性心脏病的防治已成为全世界共同关注的焦点。目前临床上对于缺血性心脏病的治疗多采用早期血运重建的方法,但该法会导致不可逆性致死性的心肌损伤—心肌缺血/再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤。因此减轻MI/R引起的心肌损害已成为临床治疗中亟待解决的首要问题。诸多研究发现,上调低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是保护MI/R的有效措施,而HIF-1α对氧敏感性极高,在常氧条件下极易降解失活。近年的动物和临床研究发现热量限制(Caloric restriction,CR)通过调控机体的代谢与免疫功能而发挥延长寿命的作用,而且对肝、肾、脑及卵巢等重要器官具有保护作用。另有研究报道CR可以上调HIF-1α的表达,因此推测CR的保护作用可能与HIF-1α有关。研究发现,适度节食可有效激活自噬,并且HIF-1α/Bnip3通路为一经典的自噬通路。CR与HIF-1α/Bnip3通路是否有关尚不清楚。此外,炎症反应是心肌缺血/再灌注损伤的重要病理特征,本实验室前期研究证实HIF-1α参与TLR4/NF-кB通路的调控,抑制TLR4/NF-кB通路可能是保护心肌的另一有效措施,而CR与TLR4/NF-кB通路之间的关系也不明确。因此,本文旨在从自噬和炎性通路的角度探究热量限制对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及可能机制。目的:1.观察热量限制能否减轻小鼠的心肌缺血/再灌注损伤;2.确定热量限制是否通过调控HIF-1α/Bnip3介导的自噬改善心肌缺血/再灌注损伤;3.探究热量限制减轻缺血/再灌注心肌损伤是否与上调HIF-1α进而抑制TLR4/NF-кB通路激活有关。方法:1.实验分组:将8月龄雄性C57BL/6小鼠随机分为5组:(1)正常饮食+假手术组(AL+Sham);(2)正常饮食+心肌缺血/再灌注组(AL+I/R);(3)热量限制+假手术组(CR+Sham);(4)热量限制+心肌缺血/再灌注组(CR+I/R);(5)热量限制+HIF-1α抑制剂YC-1+心肌缺血/再灌注组(CR+YC-1+I/R),各组n=10。正常饮食(Ad Libitum,AL)组小鼠每日自由摄食,热量限制(Caloric restriction,CR)组小鼠给予正常食量的90%,每两周递减10%,持续8周。CR之后通过结扎冠状动脉左前降支构建小鼠心肌缺血/再灌注模型(Ischemia/reperfusion,I/R),抑制剂组于术前静脉注射HIF-1α抑制剂YC-1(2 mg/kg)。2.饮食控制期间观察小鼠基本生活状态,监测体重,记录生理指标。3.采用Even’s blue/TTC染色法检测心肌梗死面积。4.HE染色法确定心肌组织的病理改变。5.利用相应试剂盒测定心肌组织氧化应激相关指标,即超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性与丙二醛(MDA)含量。6.Western blot法检测心肌组织的HIF-1α、Bnip3、Beclin-1、LC3、P62、TLR4、Iккβ、P65的蛋白表达水平。结果:1.热量限制改善小鼠基本生理指标:在实验期间持续观察小鼠的基本状态,发现进行CR干预后小鼠毛发更加光亮,形体纤瘦,动作灵活;体重监测可见CR组小鼠的体重逐渐减少,而AL组的体重稳中有升。热量限制8周后,CR组较AL组的体重、肝重、心重明显减轻(P<0.01);而胫骨长度与血糖值的变化没有统计学意义(见图1)。2.CR使小鼠术后的心肌梗死面积减小:心肌组织切片经Even’s blue/TTC双染可直观显示CR+I/R组的梗死区(灰白色区域)较AL+I/R组相比明显减少,统计结果CR+I/R组的心肌梗死面积较AL+I/R组明显降低(P<0.01)(见图2)。3.CR减轻I/R后心肌组织的病理损伤:心肌组织HE染色结果可见AL+I/R组的心肌纤维排列紊乱,伴有细胞变性、坏死、破裂。CR干预后,可见心肌纤维排列明显改善,组织结构相对整齐,病理损伤程度明显减轻(见图3)。4.CR改善I/R所致的心肌氧化应激损伤:检测结果显示与AL+I/R组相比,CR+I/R处理组的SOD与GSH-Px活性分别增加34%与30%,而MDA含量则下降了37%(P<0.01)(见图4)。5.CR促进I/R后心肌组织自噬相关蛋白的表达:与AL+I/R组相比,CR+I/R组心肌组织Beclin-1与LC3II的蛋白表达量分别增加了28%和38%(P<0.01),而P62的表达水平降低了57%(P<0.01)(见图5)。6.CR促进I/R后心肌组织HIF-1α/Bnip3通路的激活:与AL+I/R组相比,CR干预使心肌组织的HIF-1α蛋白表达量增加25%(P<0.05),同时Bnip3蛋白表达量增加了27%(P<0.05)(见图6)。7.抑制HIF-1α可逆转CR对I/R心肌的自噬上调:为明确HIF-1α是否参与自噬的调节,我们加入其抑制剂YC-1进行进一步验证。发现YC-1抑制HIF-1α的表达(P<0.05),随之发现自噬相关蛋白Beclin-1(P<0.05)、Bnip3(P<0.01)、LC3II(P<0.01)的蛋白表达量均有所降低,而P62的表达水平明显增加(P<0.01)(见图7)。8.CR可抑制心肌I/R后的TLR4/NF-кB信号通路激活:TLR4激活Iккβ使NF-кB入核从而介导炎症的发生。如图8所示,AL+I/R组心肌组织的TLR4、Iккβ、NF-кB蛋白水平显著升高,分别约为AL+Sham组的2.1倍、2.65倍、1.63倍(P<0.01)。在CR基础上行MI/R手术处理后,与AL+I/R组相比,TLR4、Iккβ、NF-кB的蛋白水平分别降低了20%(P<0.05)、21%(P<0.05)、31%(P<0.01)。9.CR对TLR4/NF-кB信号通路的激活可被HIF-1α抑制剂所阻断:在CR+I/R基础上加用HIF-1α抑制剂YC-1进行干预,发现与CR+I/R组相比,TLR4/NF-кB信号通路相关蛋白TLR4(P<0.01)、NF-кB(P<0.01)及Iккβ(P<0.05)的表达水平得到了逆转,表达量明显增加(见图9)。结论:1.八周的热量限制除未造成小鼠的明显损伤外,还能优化小鼠的基本生理指标,减小I/R后的心肌梗死面积,减轻心肌组织的病理改变,同时使心肌缺血/再灌注所致的氧化应激损伤得到明显改善。2.热量限制通过上调HIF-1α/Bnip3介导的自噬发挥对心肌缺血/再灌注损伤的缓解作用。3.热量限制对心肌/缺血再灌注损伤的保护作用与上调HIF-1α及抑制TLR4/NF-кB通路激活有关。