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转录因子Msn4是典型的C2H2型锌指蛋白,是真菌细胞调控外界逆境胁迫应答的主要转录因子,在真菌细胞的饥饿胁迫、盐胁迫、氧化胁迫、高渗透压胁迫以及低温胁迫等的应答调节中具有重要的作用,但是未见有报道研究转录因子Msn4与真菌多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids;PUFA）低温合成的关系。我们前期的研究表明产油酵母—红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235,在低温条件下细胞膜膜脂中的PUFA含量增加,促进了菌株的低温生长适应性,但具体的调节机制仍不清楚。本研究拟以红冬孢酵母YM25235菌株的Msn4同源基因—RkMsn4出发,研究其对YM25235菌株低温生长适应性和PUFA低温合成的影响。首先,对15℃低温条件下YM25235菌株中基因RkMsn4的mRNA转录水平以及低温条件培养下的红冬孢酵母YM25235菌株的甘油含量进行分析。结果显示,15℃条件下培养1小时RkMsn4基因的mRNA转录水平开始提高,培养8h RkMsn4的mRNA转录水平是30℃条件下mRNA转录水平的1.41倍,随着低温培养时间的增加Rk Msn4的mRNA转录水平增加,同时甘油的含量也明显增加。这些结果初步表明,RkMsn4基因可能与红冬孢酵母YM25235菌株的低温生长适应性有关。对RkMsn4基因进行克隆与序列分析,结果显示,PCR扩增得到的片段包含一个大小为2625 bp的完整开放阅读框,编码874个氨基酸,编码蛋白分子量大小为94.5kD。序列分析发现RkMsn4基因编码的氨基酸中存在具有Msn4蛋白类似的高度保守的Zn F-C2H2结构域、蛋白激酶结合位点、Fungaltrans结构域以及CHAD结构域。氨基酸序列比对的结果显示,RkMsn4基因编码的氨基酸序列与粘红酵母的Msn4基因编码的氨基酸序列相同性（identity）为99%的,与白冬孢酵母的Msn4基因编码的氨基酸序列相同性为70%。系统进化分析显示RkMsn4基因编码的氨基酸序列与红酵母类Msn4蛋白氨基酸序列的亲缘关系更近。这些结果表明我们克隆得到的RkMsn4基因是一个潜在的Msn4基因。为了分析RkMsn4基因与红冬孢酵母YM25235低温生长适应性和PUFA低温合成之间的关系,我们构建了RkMsn4基因重组表达质粒pRHRkMsn4,并转化YM25235菌株进行过表达。环境胁迫抗性分析结果表明,RkMsn4基因过表达可以明显提高YM25235菌株中甘油的含量,增强了YM25235菌株对高渗透压胁迫、盐压胁迫以及低温胁迫的耐受性。进一步的脂肪酸GC分析中显示,15℃培养后,RkMsn4基因过表达的YM25235菌株中亚油酸（Linoleic acid;LA）和α-亚麻酸（α-Linolenic acid;ALA）的含量分别从对照菌株中的16.81%和6.14%提高到31.56%和17.32%,而油酸（Oleic acid;OA）的含量明显减少。进一步分析结果还显示,RkMsn4基因过表达促进了15℃条件下催化油酸转化为LA和ALA的Δ12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平提高了2.54倍。这些结果都可以说明,RkMsn4基因过表达提高了YM25235菌株中LA和ALA合成相关基因RKD12的mRNA转录水平,增加PUFA的合成量,提高YM25235菌株低温生长适应性。我们进一步通过酵母单杂交实验分析RkMsn4与RKD12基因启动子序列RKD12P之间的相互作用,揭示转录因子RkMsn4与RKD12基因mRNA转录水平低温增加之间的关系。首先克隆RKD12基因上游3617bp序列,序列分析显示该序列具有真核启动子特征性的序列原件TATA-box、TFIIB识别元件BRE、起始子initiator、CAAT-box、GC-box和下游启动子元件DPE,以及与环境胁迫应答相关的应激反应元件（STRE）、低温反应元件（LTRE）和金属响应元件（MRE）。为了验证其功能,将RKD12P插入载体pRH2304中替换RtGFP基因上游的启动子PRtGPD1,构建新的重组质粒pRHRKD12PGFP,然后转化YM25235菌株,荧光显微观察和Western杂交分析结果表明RKD12P具有启动子功能。再继续将启动子RKD12P与RkMsn4基因插入到酵母单杂交系统中的pAbAi、pGADT7-Rec2质粒上,构建重组质粒pAbAiRKD12P和pGADT7Rec2RkMsn4并转化酿酒酵母Y1H酵母中,抗性分析表明转录因子RkMsn4与启动子RKD12P之间发生相互作用。该结果表明,低温条件下RkMsn4基因编码蛋白可能作为转录因子与RKD12P相互作用,促进RKD12基因的转录。为了进一步揭示低温条件下与RkD12基因m RNA的转录提高相关的其他调节蛋白,我们通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）方法分析低温条件下与启动子RkD12P结合的其他核蛋白。将RkD12P进行生物素标记后与链霉亲和素磁珠结合,分别与15℃和30℃条件下培养的YM25235菌株核蛋白进行孵育,分离与RkD12P结合蛋白后进行质谱鉴定。结果显示,共获得14种核定位蛋白,其中有6种蛋白是15℃和30℃培养样品中同时存在,有2种只存在30℃培养样品中,另有6种只存在于15℃培养样品中,而且低温样品获得的这6种中有部分蛋白已有报道与环境胁迫响应有关,其对RkD12基因低温转录调节的影响将在后续工作中进行研究。我们前期分析表明,红冬孢酵母YM2535是一株产油菌株,同时合成β-胡萝卜素、红酵母素和圆酵母素等类胡萝卜素,因此,本研究也同时分析了过表达RkMsn4基因对YM25235菌株合成类胡箩卜素和油脂的影响。提取30℃培养的RkMsn4基因过表达菌株中的类胡箩卜素及油脂分析部分类胡萝卜素及油脂合成相关基因mRNA转录水平变化。结果表明,RkMsn4基因过表达促进了类胡萝卜素合成相关基因mRNA转录水平,导致类胡箩卜素的含量明显提高,而与油脂合成相关基因mRNA转录水平虽然提高了,但油脂含量却小幅度下降,推测可能与胞内乙酰CoA过多进入类胡萝卜素的合成途径有关。综上所述,红冬孢酵母YM25235的RkMsn4基因过表达提高YM25235菌株对渗透压胁迫、盐胁迫以及低温胁迫的耐受性,还能促进低温下RKD12基因mRNA转录水平以及PUFA合成增加进一步提高了YM25235菌株的低温生长适应性,而且RkMsn4蛋白通过蛋白质-DNA相互作用的方式对RKD12基因mRNA的低温转录水平进行调节。此外,RkMsn4基因过表达促进YM25235菌株中类胡箩卜素的合成,但引起油脂合成水平下降。本研究结果将有助于最终揭示红冬孢酵母YM25235低温生长适应性机制、PUFA低温合成的信号转导途径及其调节机制、以及RkMsn4蛋白与YM25235菌株油脂和类胡箩卜素合成之间的关系,为进一步的相关理论和应用研究打下了基础。