青枯病(bacterial wilt)由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起细菌性土传病害,是马铃薯最大的细菌性病害,在热带、亚热带生产区域普遍发生,目前还没有有效的防治手段,常造成严重减产。马铃薯栽培种(Solanum tuberosum)缺乏青枯病抗性,同时由于种间杂交障碍,野生和近缘物种的抗性资源得不到利用,创制抗性材料成为马铃薯抗青枯病育种需要解决的首要问题。本实验室通过体细胞融合,获得了马铃薯+茄子的体细胞杂种,部分杂种成功获得了茄子融合亲本的青枯病抗性。为明确抗性的遗传基础,以有效利用这一新型抗病资源,本研究综合运用基因组原位杂交和物种特异分子标记方法,明确了体细胞杂种的基因组组成成分;通过与抗性水平的关联,揭示了体细胞杂种中的茄子抗性基因位点;结合抗感体细胞杂种的转录组分析及差异基因的表达特征,提出了与抗病相关的候选基因并筛选了相应的抗性选择标记;通过系统的细胞学和植物学表型鉴定,提出了抗青枯病体细胞杂种利用的育种策略与方法。主要研究结果如下:1.抗性鉴定筛选出了具有青枯病抗性的体细胞杂种。对前期获得的感青枯病马铃薯AC142(S.tuberosum双单倍体)和抗青枯病茄子508.3(S.melongena)对称融合体细胞杂种90份及其融合亲本的试管苗进行了室内青枯菌接种的抗性评价。所用青枯病菌株为HZAU007(演化Ⅱ型,生化ⅡB/Ⅰ型)。鉴定结果表明,6个体细胞杂种达到了中抗及以上水平,24个体细胞杂种为中感,其他60个体细胞杂种为感病。这说明来源于茄子的青枯病抗性成功转移到了部分体细胞杂种中,提供了资源创新和本研究的材料基础。2.倍性分析表明复杂的体细胞杂种倍性可能造成性状多样性分离。通过流式细胞仪测定以及染色体压片计数的方法进行了体细胞杂种的倍性鉴定,结果表明,体细胞杂种倍性复杂,有45个四倍体,4个七倍体,2个八倍体,剩余的38个为非整倍体。这种倍性水平的复杂性可能反映出遗传上的多样性,提供了体细胞杂种性状分离的遗传基础。3.染色体原位杂交结合物种特异标记筛选到体细胞杂种青枯病抗性相关的遗传位点。本研究采用GISH(基因组原位杂交)对体细胞杂种的基因组组分进行分析,同时从236对茄子SSR引物中筛选得到44对茄子特异的SSR引物,用以分析体细胞杂种的茄子特异SSR位点的保留情况。结果表明,所有体细胞杂种均保留有全套马铃薯基因组,而茄子基因组的保留则分为两类:一类具有完整的茄子染色体,可通过GISH检测到茄子染色体的保留,这类体细胞杂种共有12个;另一类只具有茄子特异的SSR位点,而GISH检测不到完整的茄子染色体或染色体片段,这类体细胞杂种有78个。在基因组检测过程中还观察到了马铃薯染色体的丢失和马铃薯茄子染色体的重排现象。这些结果说明,亲缘关系较远的体细胞融合,亲本基因组的整合可能受到许多不明原因的影响。通过杂种基因组构成与青枯病抗性的关联,找到了7个可能与抗性相关的茄子SSR位点,为挖掘抗病相关基因提供了条件。4.转录组分析筛选获得并初步验证了体细胞杂种青枯病抗性候选基因。挑选具有抗感差异且只含有茄子SSR位点的体细胞杂种,分别构建抗感池并进行转录组分析,找到了抗感之间差异表达的15个茄子基因。将这些茄子基因的位置与抗性相关的7个SSR位点进行比对,获得了两个可能与青枯病抗性相关的茄子基因Sm PGH1和Sm GSTZ5。进一步进行这两个基因在不同抗感体细胞杂种中的表达分析,表明仅Sm PGH1基因在抗性材料中受病原诱导,可能在体细胞杂种的抗青枯病中发挥重要作用。5.提出了体细胞杂种育种利用的植物学表型依据和抗性选择的分子标记。本研究系统进行了体细胞杂种的植物学表型鉴定,大部分体细胞杂种的表型都偏向于其马铃薯融合亲本AC142,可以形成块茎。部分体细胞杂种能够开花,形成具有活力的花粉,这为后期的育种利用奠定了基础。同时根据Sm PGH1的序列及连锁标记,提出了育种后代抗性筛选的分子标记辅助选择策略。