研究背景和研究目的急性肢体缺血(acute limb ischemia, ALI)是由动脉栓子、动脉血栓形成或者动脉损伤导致的肢体远端动脉血流突然中断,是血管外科最常见的动脉性疾病之一。近年来,对于该病的诊断和治疗较以往都有了显著地进步,但是其仍然导致较高的截肢率和病死率,一个月内截肢率约为10%-30%,病死率约为15%。急性缺血后3小时即开始出现肌肉细胞坏死、微循环障碍、感觉丧失及运动丧失,6小时后肌肉出现不可逆坏死,因此对于急性肢体缺血的治疗原则为尽快恢复肢体血运,一般在6小时内重建血运可有效避免截肢,最晚不能超过24小时。但是肢体恢复血运后,常导致肢体缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, IR)损伤,引起肌肉组织和血管组织损伤,以及远隔器官如心、肺、肾、肠道等器官组织的炎性损伤等,严重者可导致代谢性酸中毒,高钾血症,急性肾功能衰竭,多器官功能障碍综合征,甚至造成病人死亡。而且,很多ALI病人同时患有高血压、冠心病、风湿性心脏病、脑梗塞等多种疾病,其发病之后身体短时间内却不能耐受血运重建手术,那么对于这种病人如何尽量延长外科治疗时间窗,尽量保护血管结构和功能正常以利于日后肢体血运恢复就成为了一个亟待解决的问题。因此对于急性肢体缺血/再灌注发生发展过程中的血流动力学、病理及分子生物学的深入研究显得尤为重要,将对ALI的外科治疗、药物治疗以及预后的改善提供理论依据以及新的线索。缺血刺激及缺血后再灌注均可引发炎症因子介导的炎症瀑式反应,是导致缺血性损伤以及再灌注损伤的重要原因。在急性肢体缺血/再灌注过程中,血管组织发生的炎症反应,常会引起包括肿瘤坏死因子α (TNF-α),白介素(IL)在内的多种炎症因子的合成与分泌,刺激细胞粘附分子(ICAM)、血管细胞粘附分子(VCAM)表达上调,趋化聚集白细胞,对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞造成炎性损伤。而且,缺血刺激及缺血后再灌注引发的炎症反应不仅可以引起血管平滑肌细胞发生表型转化,而且可以造成细胞外基质成份的改变,最终导致血管重构及血管舒缩功能障碍。总之,血管组织发生的炎症反应造成血管壁细胞损伤、血管重构以及功能障碍,可能对缺血肢体以及再灌注肢体的血流动力学产生重要影响。因此,我们推测减轻甚至消除血管组织本身的炎症反应可以起到保护血管结构和功能的作用,有利于减轻肢体缺血和缺血/再灌注造成的炎性损伤,有助于肢体血运的改善。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box protein1, HMGB1)是一种高度保守的DNA结合非组蛋白,广泛存在于真核生物的细胞核内,其在核内可以维持核小体结构、稳定染色质、调节基因转录、参与DNA重组以及修饰类固醇激素受体。研究发现,HMGB1释放到细胞外时作为炎症因子广泛参与了缺血再灌注损伤、组织损伤后修复、动脉粥样硬化、炎症反应等病理生理过程。HMGB1作为早期炎症因子引发的炎症瀑式反应可导致缺血再灌注损伤,其可以上调ICAM、VCAM的表达,刺激巨噬细胞、单核细胞等产生TNF-α、IL,促进白细胞和血小板聚集,趋化巨噬细胞、平滑肌细胞迁移等。研究发现,HMGB1在心、脑、肺、肝、肾、肠道和骨骼肌组织的缺血再灌注过程中均有强阳性表达,而且以HMGB1为靶点的治疗措施可明显减轻实质脏器和肌肉组织的再灌注损伤。但是对于HMGB1在急性肢体缺血/再灌注过程中动脉血管组织炎症反应中的表达和作用机制尚未见大规模研究报道。我们推测在急性肢体缺血/再灌注中HMGB1通过诱发和维持炎症瀑式反应影响了血管组织的正常结构和功能,从而影响了肢体的血流动力学变化。肝素是广泛应用于缺血性疾病的一种临床药物,近年来临床研究发现肝素可以通过减少白细胞的聚集黏附、抑制血小板的活化、以及抑制弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的释放起到抗炎作用。体外实验表明肝素还可以抑制脂多糖(LPS)诱导的单核细胞分泌肿瘤坏死因子和白介素。此外,肝素可以结合HMGB1并改变其构型,从而影响其与RAGE受体的结合。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate, EP)是以HMGB1为靶点的治疗药物,可以有效抑制HMGB1的合成与释放,降低炎症细胞因子的表达,并且减轻缺血/再灌注损伤诱发的全身性炎症反应。因此,我们将在本研究中应用肝素和丙酮酸乙酯进行干预,观察其对血管组织炎症反应和肢体血流动力学的影响。激光多普勒血流成像技术(laser Doppler perfusion imaging, LDPI)是利用血流位移产生的多普勒效应将血流以彩色图像的形式进行显示。PU值(perfusion unit)为LDPI测量的基本指标,其可表示测量深度内局部组织血流量的大小及改变,PU值的变化与测量范围内的红细胞移动速度和数量密切相关,mean PU值可直接反映区域组织内的血流灌注情况,max PU值则可以反映主干血管血流速度的大小。本研究将应用LDPI技术检测肢体血运并进行定性和定量分析。本研究将通过构建急性肢体缺血/再灌注大鼠模型,对肢体血流动力学变化、血管组织炎症反应过程、其对肢体血运的影响以及HMGB1在此过程中具体的作用机制进行了深入的研究,研究结果可以从炎症因子的角度阐释急性缺血以及缺血/再灌注过程中肢体血流动力学的改变、血管组织的病理改变以及对肢体血运的影响,并将为急性肢体缺血以及缺血后再灌注损伤的临床治疗提供理论依据和新的线索。研究内容第一部分：应用激光多普勒血流成像技术对大鼠后肢急性缺血/再灌注模型的评估及血流动力学研究。第二部分：对急性肢体缺血／再灌注过程中高迁移率族蛋白B1在动脉血管组织中的表达的研究。第三部分：对高迁移率族蛋白B1在急性肢体缺血／再灌注过程中作用机制的研究。研究方法第一部分：1.动物模型的建立和分组：将Wistar雄性大鼠分为假手术组,急性缺血组,肝素治疗缺血组,再灌注组,肝素治疗再灌注组。利用血管夹阻断股动脉结合止血带环扎后肢根部建立急性肢体缺血模型,急性缺血三小时后取出血管夹和止血带开放血流制成缺血/再灌注模型。肝素治疗组则于术后即刻皮下注射肝素,每公斤体重150U,一天两次。2.大鼠后肢体征变化：分别在急性缺血后1、3、6、9、12、18、24小时和再灌注后1、3、6、9、12、18、24小时观察患肢大体表现。3.利用激光多普勒血流成像技术(LDPI)检测大鼠后肢血流动力学变化：在室温下,将大鼠麻醉后平卧,扫描参数设置为：扫描模式image scan,扫描距离15cm,扫描范围20X15cm,分辨率256X64,扫描速度media。缺血组及肝素治疗缺血组：在股动脉夹闭后第1、3、6、9、12、18、24小时,对双后肢进行扫描。再灌注组及肝素治疗再灌注组：在股动脉重新开放后第1、3、6、9、12、18、24小时,对双后肢进行扫描。假手术组：大鼠麻醉后平卧,对双后肢进行扫描。4.收集组织：分别在急性缺血后1、3、6、9、12、18、24小时和再灌注后1、3、6、9、12、18、24小时处死大鼠并收集股动脉备用。第二部分：1.动物模型的建立和分组、血管组织的收集均同第一部分。2.免疫荧光检查：在动脉血管组织中观察HMGB1蛋白的表达及分布。3.用Western blot方法检测动脉血管中HMGB1蛋白的表达水平和规律,以及肝素对蛋白表达的影响。4.用Syber Green实时荧光定量PCR方法检测动脉血管中HMGB1mRNA的表达水平和规律,以及肝素对mRNA表达的影响。第三部分：1.动物模型的建立和分组：将Wistar雄性大鼠按体重随机分为缺血组和再灌注组。缺血组分为：(1)假手术组(对照组)；(2)缺血组；(3)肝素治疗组;(4)肝素+EP治疗组；每组6只。再灌注组分为：(1)假手术组(对照组)；(2)再灌注组；(3)肝素治疗组；(4)肝素+EP治疗组；每组6只。手术过程同第一部分。肝素治疗组术后即刻皮下注射肝素,每公斤体重150U,一天两次。肝素+EP治疗组术后除注射肝素外,同时腹腔注射EP,每公斤体重40mg,一天两次。2.大鼠肢体血流测定以及血管组织的收集：根据第二部分的研究结果,分别取HMGB1表达高峰时刻进行肢体血流测定以及血管组织的收集,血流测定及取材过程同第一、二部分。3.用HE、EVG染色法观察血管组织形态及结构的病理改变。4.免疫组织化学染色法观察血管组织中HMGB1、TNF-α、IL-6、ICAM、VCAM、 MMP-2、MMP-9、α-SM actin的表达情况。5.用Western blot方法检测血管组织中HMGB1的表达水平。6.用Syber Green实时荧光定量PCR方法检测血管组织中HMGB1、TNF-α IL-6、ICAM、VCAM、MMP-2、MMP-9、α-SM actin的mRNA的表达水平。研究结果第一部分：1.成功建立大鼠后肢急性缺血/再灌注模型：急性缺血后即刻后爪出现苍白、皮温低等缺血表现,第9小时开始出现紫绀并逐渐加重。肝素治疗后缺血症状减轻,但是第12小时仍出现紫绀并逐渐加重。两组大鼠的健侧肢体后爪均未出现苍白、紫绀、肿胀等表现。缺血后再灌注即刻后爪出现肿胀、皮温升高等表现,第18个小时症状开始逐渐减轻。肝素治疗后症状明显减轻,而且在24小时内大致恢复正常。两组大鼠的健侧肢体后爪均未出现苍白、紫绀、肿胀等表现。2.缺血组：术侧肢体的mean PU及max PU术后均迅速下降,之后至第24小时始终维持在极低水平,证实大鼠后肢急性缺血模型构建成功。术后健侧肢体的血流也出现了一过性的改变,健侧肢体mean PU和max PU于术后缓慢降低,3小时后逐渐恢复。缺血肢体的mean PU与max PU存在一定的相关性(r=0.14,P=0.17)。3.肝素治疗缺血组：肝素治疗后mean PU和max PU均较缺血组无明显提高(PmeanPU=0.75, PmaxPU=0.69),术侧肢体血流仍迅速下降并在24小时内始终维持在极低水平。术后健侧肢体的血流仍然出现一过性改变,健侧肢体mean PU和max PU降低后从第3小时开始逐渐恢复。4.再灌注组：再灌注后术侧肢体的mean PU及max PU在6小时内均缓慢升高,之后mean PU于再灌注后12小时下降至最低,max PU于再灌注后9小时下降至最低,随后二者均缓慢升高,但是至再灌注后24小时仍未能恢复至正常水平。再灌注后健侧肢体的血流出现了一过性的改变,术后健侧肢体mean PU和max PU一过性降低并于9小时后逐渐恢复。再灌注肢体的mean PU与max PU存在明显的相关性(r=0.68,P<0.001)5.肝素治疗再灌注组：肝素治疗后mean PU和max PU均较再灌注组明显提高(PmeanPU<0.001, PmaxPU<0.001),再灌注后术侧肢体的mean PU及max PU均缓慢上升,期间未在出现明显的降低,但是至再灌注后24小时二者均未能恢复至正常水平。再灌注后健侧肢体的血流仍出现一过性的改变,术后健侧肢体mean PU和max PU一过性降低并于9小时后逐渐恢复。4.6假手术组：双侧肢体血运良好,双侧肢体PU值基本一致。第二部分：1.急性缺血后HMGB1蛋白和mRNA在动脉血管组织中呈强阳性表达,但二者表达规律不同免疫荧光显示：假手术组动脉血管组织中HMGB1荧光强度非常微弱,而且只存在于细胞核中。急性缺血1小时后,HMGB1在血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核内的表达开始增强,第6小时胞浆内出现强荧光信号而且血管壁全层均呈强荧光信号,第12小时胞浆内荧光信号开始减弱,第24小时细胞核和胞浆内仍呈强荧光信号。Western blot分析发现：假手术组股动脉组织中HMGB1蛋白为阴性,急性缺血后1小时蛋白表达开始增加,第9小时达到表达高峰,之后至第24小时一直维持在高水平蛋白表达。HMGB1蛋白表达与缺血时间呈正相关,P<0.001,相关系数r=0.801。PCR分析发现：假手术组股动脉组织中HMGB1mRNA为阳性,急性缺血后1小时mRNA表达开始增加,至第6小时达到表达高峰,之后至第24小时表达水平逐渐下降。HMGB1mRNA表达与缺血时间呈负相关,P<0.001,相关系数r=-0.847。2.肝素可以明显降低急性缺血后HMGB1蛋白和mRNA在动脉血管组织中的表达免疫荧光显示：与缺血组相比,肝素治疗缺血组各时间点血管组织中的荧光信号均减弱,但是HMGB1在血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核内的表达仍在缺血1小时后开始增强,第6小时胞浆内出现强荧光信号而且血管壁全层呈强荧光信号,第24小时细胞核和胞浆内荧光信号开始减弱。Western blot分析发现：肝素治疗缺血组蛋白表达较缺血组明显降低(P<0.001),虽然急性缺血后1小时蛋白表达仍开始增加,但是表达高峰推迟到第18小时,其表达水平与缺血组表达高峰相比降低幅度达0.526±0.047,之后至第24小时有所降低。HMGB1蛋白表达与缺血时间呈正相关,P<0.001,相关系数r=0.926。PCR分析发现：肝素治疗缺血组HMGB1mRNA表达较缺血组明显降低(P=0.003),急性缺血后1小时mRNA表达开始增加,至第6小时达到表达高峰,其高峰表达水平与缺血组表达高峰相比降低幅度达0.348±0.02,之后至第24小时表达水平逐渐下降。HMGB1mRNA表达与缺血时间呈负相关,P<0.001,相关系数r=-0.863。3.急性缺血/再灌注后HMGB1蛋白和mRNA在动脉血管组织中呈强阳性表达,而且二者表达规律趋于一致免疫荧光显示：再灌注1小时后,HMGB1在血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核内的表达开始增强,第3小时胞浆内出现强荧光信号而且血管壁全层均呈强荧光信号,第18小时胞浆内荧光信号开始减弱,第24小时细胞核和胞浆内存在强荧光信号。Western blot分析发现：再灌注后1小时HMGB1蛋白表达开始增加,第12小时达到表达高峰,之后至第24小时呈下降趋势。HMGB1蛋白表达与再灌注时间无明显相关性,P=0.176。PCR分析发现：HMGB1mRNA与蛋白表达规律趋于一致,再灌注后1小时mRNA表达开始增加,至第12小时达到表达高峰,之后至第24小时表达水平逐渐下降。HMGB1mRNA表达与再灌注时间无明显相关性,P=0.12。4.肝素可以明显降低急性缺血/再灌注后HMGB1蛋白和mRNA在动脉血管组织中的表达免疫荧光显示：与再灌注组相比,肝素治疗再灌注组各时间点血管组织中的荧光信号均减弱,但是HMGB1在血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核内的表达仍在再灌注1小时后开始增强,第3小时胞浆内出现强荧光信号而且血管壁全层呈强荧光信号,第18小时细胞核和胞浆内荧光信号开始减弱。Western blot分析发现：肝素治疗再灌注组蛋白表达较缺血组明显降低(P<0.001),虽然再灌注后1小时蛋白表达仍开始增加,但是表达高峰提前到第6小时,其表达水平与再灌注组表达高峰相比降低幅度达0.63±0.021,之后至第24小时保持稳定的低水平表达。HMGB1蛋白表达与再灌注时间无明显相关性,P=0.839。PCR分析发现：肝素治疗再灌注组mRNA表达较再灌注组明显降低(P<0.001), mRNA与蛋白表达规律仍趋于一致,再灌注后1小时mRNA表达开始增加,至第6小时达到表达高峰,其表达水平与再灌注组表达高峰相比降低幅度达0.531±0.024,之后至第24小时保持稳定的低水平表达。HMGB1mRNA表达与再灌注时间无明显相关性,P=0.058。第三部分：1.抑制HMGB1的合成与释放对缺血肢体的血运无明显的改善肢体血流图显示：经治疗后的大鼠缺血肢体血运无明显改善,mean PU与max PU均无明显提高(Pmean PU=0.12, PmaxPU=0.924)。Western blot显示：经治疗后的大鼠缺血肢体血管组织中的HMGB1蛋白表达明显降低(P<0.001)。相关性分析显示HMGB1蛋白表达与mean PU和maxPU之间存在一定的负相关性(rmeanPU=-0.41,Pmean PU=0.049;rmax PU=-0.39,PmaxPU=0.059)。2.急性肢体缺血刺激血管组织表达多种炎症因子HE和EVG染色显示：血管内皮细胞和血管平滑肌细胞大致保持正常,但是缺血可引起血管壁胶原纤维的降解,弹力层的波浪状结构则无明显的破坏。经治疗后胶原纤维的降解可明显减轻,弹力层结构也保持完整。免疫组化显示：缺血可引起血管组织发生强烈的炎症反应,HMGB1、TNF-α、 IL-6、ICAM、VCAM、MMP-2、MMP-9、α-SM actin的表达均明显升高,广泛存在于内皮细胞和／或平滑肌细胞,但是其表达强度各不相同。经治疗后各炎症因子的表达水平均明显降低甚至完全消失(P<0.001)。相关性分析显示HMGB1蛋白的表达与各炎症因子的表达之间存在明显的正相关性,抑制HMGB1的表达可明显减弱缺血引起的血管组织炎症反应。PCR显示：缺血可引起血管组织中HMGB1、TNF-α、IL-6、ICAM、VCAM、 MMP-2、MMP-9、α-SM actin的mRNA表达明显升高,经治疗后各炎症因子的mRNA表达均明显降低(P<0.001)。3.抑制HMGB1的合成与释放可明显改善再灌注肢体的低灌注状态肢体血流图显示：经治疗后的大鼠再灌注肢体血运明显改善,mean PU与max PU均明显提高(Pmean PU<0.001, Pmax PU<0.001)。Western blot显示：经治疗后的大鼠缺血肢体血管组织中的HMGB1蛋白表达明显降低(P<0.001)。相关性分析显示HMGB1蛋白表达与mean PU和maxPU之间存在明显的负相关性(rmean PU=-0.74, Pmean PU<0.001; rmax PU=-0.66, PmaxPu<0.001)。4.急性肢体缺血后再灌注刺激血管组织表达多种炎症因子并引起血管壁重构HE和EVG染色显示：再灌注可引起血管壁胶原纤维的降解,弹力层的波浪状结构被破坏,部分内皮细胞消失,平滑肌细胞数量减少,经治疗后胶原纤维的降解明显减轻,弹力层结构也可大致保持正常,内皮细胞和平滑肌细胞大致保持正常。免疫组化显示：缺血后再灌注可引起血管组织发生强烈的炎症反应,HMGB1、 TNF-α、IL-6、ICAM、VCAM、MMP-2、MMP-9、α-SM actin的表达明显升高,广泛存在于内皮细胞和／或平滑肌细胞,但是其表达强度各不相同,经治疗后各炎症因子的表达均明显降低甚至消失(P<0.001)。相关性分析显示HMGB1蛋白的表达与各炎症因子的表达之间存在明显的正相关性,抑制HMGB1的表达可明显减弱再灌注引起的血管组织的炎症反应。PCR显示：缺血后再灌注可引起血管组织中HMGB1、TNF-a、IL-6、ICAM. VCAM、MMP-2、MMP-9、α-SM actin的mRNA表达明显升高,经治疗后各炎症因子的mRNA表达均明显降低(P<0.001)。结论1.使用止血带结合血管夹可以成功构建急性肢体缺血/再灌注大鼠模型,LDPI技术可以定性和定量的评估该动物模型并研究其血流动力学变化。急性缺血肢体和缺血后再灌注的肢体均呈低灌注状态,前者呈持续缺血状态,后者则随着再灌注时间而呈现特征性的波动,肝素治疗并不能完全改善这种低灌注状态。急性肢体缺血或是缺血后再灌注过程中,健侧肢体血流均会出现一过性的低灌注改变,这可能与构建动物模型的手术方式以及动物的全身血流动力学反应有关。2.急性肢体缺血和缺血后再灌注均可导致动脉血管组织迅速发生炎症反应,大量表达HMGB1蛋白和mRNA,是炎症细胞因子的重要来源。急性肢体缺血和缺血后再灌注引发的HMGB1蛋白和mRNA的表达规律并不相同,从炎症因子的角度阐释了动脉血管的炎症反应过程。肝素可能通过干扰HMGB1在表达过程中的正反馈机制从而降低了HMGB1的表达水平。3.减轻血管组织炎症反应可以显著改变再灌注肢体的低灌注状态,但是对缺血肢体的血运无明显改善。急性肢体缺血和缺血后再灌注过程中血管组织均存在不同程度的细胞损伤、血管重构和功能障碍,是引起肢体血流动力学变化的重要因素。HMGB1可以通过刺激血管组织上调相关炎症因子的表达,造成血管内皮细胞、平滑肌细胞的损伤,引起血管结构和功能障碍,从而对肢体血运产生影响。