【摘 要】
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）不仅能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键,并能将最小单位的支链分解。与淀粉酶和糖化酶配合使用,可大幅度提高液化后淀粉的水解速度和糖化率,显著提高发酵和食品行业的原料利用率。然而,不论是同源表达还是异源表达,普鲁兰酶的表达量均较低。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）能够大量表达杀虫蛋白,机理是其杀虫蛋白基因的5’端的上游连
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）不仅能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键,并能将最小单位的支链分解。与淀粉酶和糖化酶配合使用,可大幅度提高液化后淀粉的水解速度和糖化率,显著提高发酵和食品行业的原料利用率。然而,不论是同源表达还是异源表达,普鲁兰酶的表达量均较低。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）能够大量表达杀虫蛋白,机理是其杀虫蛋白基因的5’端的上游连接有一个保守的SD（Shine-Dalgarno）序列,在3’端连接有一个茎环结构序列,使得该基因的m RNA非常稳定。因此,本研究构建了这种普鲁兰酶稳定表达载体,在大肠杆菌中表达,表达量显著提高。主要的研究结果如下。（1）从克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）HN9中克隆得到普鲁兰酶基因（pul A）,人工合成了苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的茎环结构序列（3t）。（2）以大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒p HT43为骨架,将pul A及其连接有SD或茎环结构的序列分别置于诱导型启动子Pgrac下游,分别构建了pul A异源表达载体p HT43-pul A、p HT43-SD-pul A、p HT43-pul A-3t和p HT43-SD-pul A-3t。四个表达载体中,pul A与SD或茎环结构序列的连接方式分别是pul A（未连接SD或茎环结构序列,作为对照）、5′-SD-pul A-3′、5′-pul A-3t-3′和5′-SD-pul A-3t-3′。（3）将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,表达p HT43-pul A,p HT43-SD-pul A,p HT43-pul A-3T和p HT43-SD-pul A-3T四种载体的胞内酶活力分别为0.0344U/m L、12.233 U/m L、0.0378 U/m L和24.111 U/m L。（3）对重组质粒在大肠杆菌中的基因表达量进行了半定量RT-PCR分析。其中p HT43-SD-pul A,p HT43-pul A-3T和p HT43-SD-pul A-3T的表达量分别比p HT43-pul A提高了2.3倍,1.4倍和3.4倍。（4）将p HT43-pul A,p HT43-SD-pul A,p HT43-pul A-3t和p HT43-SD-pul A-3t用ScaⅠ酶切,用Easy Geno快速克隆重组技术将Kana抗性基因表达盒与上述酶切载体连接,并将改造后的质粒分别命名为p KAC-pul A,p KAC-SD-pul A,p KAC-pul A-3T和p KAC-SD-pul A-3T。以上实验结果表明,在结构基因的上游连接SD序列,对提高基因的表达量是十分必要的。在结构基因的上游连接SD序列的同时,在下游连接茎环结构序列,可进一步提高基因的表达量。
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