人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一种在人群中传播非常广泛的病毒,属于疱疹病毒目疱疹病毒科β疱疹病毒亚科。大多数感染是无症状的,但对于免疫力低下的患者可能就会产生十分严重的后果,例如:器官移植、AIDS患者、新生儿等。人巨细胞病毒中含有大量开放阅读框对于病毒复制不是必须的,但是对于免疫逃逸有重要功能。在这些开放阅读框的UL/b’区域的UL147编码的蛋白属于趋化因子家族和免疫逃逸密切相关。HCMV UL147表达的蛋白vCXCL2属于CXC趋化因子家族。本研究经pET32a质粒构建原核表达载体,IPTG诱导表达vCXCL2从而免疫新西兰大白兔制备anti-vCXCL2多克隆抗体。实验方法:(1)构建pET32a-UL147重组质粒;(2)重组质粒pET32a-UL147诱导表达条件优化;(3)诱导表达vCXCL2 Ni柱亲和层析纯化;(4)多克隆抗体的制备及鉴定。实验结果:(1)PCR获得的HCMV UL147基因选择BamHⅠ与HindⅢ酶切位点构建重组质粒pET32a-UL147;(2)BL21菌株中诱导表达优化条件为:最佳诱导温度为20℃,诱导时间为6h,IPTG浓度为1 mM/ml;(3)诱导表达重组融合蛋白经镍柱亲和层析,咪唑浓度为100 mM/L条件下洗脱,纯化蛋白样液SDS-PAGE经灰度扫描纯度为98%;(4)四免得到的兔血清经ELISA检测,其效达100,000。结论:构建重组质粒pET32a-UL147,经诱导表达蛋白纯化后制备多克隆抗体,其能有效检测vCXCL2。传统药物在HCMV感染治疗方面有着积极的作用,缺点是毒副作用高、耐药性。大量研究表明,工程化核酶P(M1GS)可通过阻断病毒关键基因的表达而有效抑制病毒复制。本研究:体外筛选优于野生型M1 RNA剪切活性及结合活性的核酶R388。基于高催化活性的核酶突变体R388和野生型M1 RNA设计了靶向MCMV AS基因的工程化核酶R388-AS和M1-AS。AS基因编码的蛋白酶对HCMV衣壳蛋白的成熟十分重要。相对于野生型M1-AS,R338-AS在体外催化活性至少提高200倍。MCMV感染的细胞中,R338-AS抑制病毒AS的表达在98-99%,子代病毒量下降15,000倍。SCID小鼠模型实验中,R338-AS活性相比野生型M1-AS更高抑制AS表达进而影响病毒的复制,提高小鼠的生存率。