论文部分内容阅读
Monacolin K是红曲霉次级代谢过程的产物,它通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)有效降低胆固醇合成,对心脑血管疾病有显著疗效。红曲霉生长缓慢、发酵周期长是目前生产上面临的一大难题。本文对烟色红曲霉生长过程中孢子和菌丝形态变化、生物量积累、Monacolin K的合成进行了比较系统的研究。研究了环境条件和培养基组成对烟色红曲霉孢子积累的影响,探讨了烟色红曲霉形态变化与Monacolin K积累之间的关系,优化出高产Monacolin K的条件。在高产Monacolin K的同时检测了桔霉素的情况,保证其安全型以满足实际生产需求。通过实时荧光定量PCR测定了生长繁殖有关基因和Monacolin K合成相关基因的变化,为研究烟色红曲霉生长和次级代谢产物合成提供了参考,得到以下主要结果:研究了红曲霉CG-6在米曲汁、麦芽汁、PDA、GPA培养基上的生长、产孢和次级代谢产物的积累情况,发现米曲汁和麦芽汁培养基有利于红曲霉CG-6有性孢子和生物量的积累但不利于Monacolin K和黄色素的产生,GPA培养基有利于分生孢子和菌丝的积累,红曲霉CG-6虽然在PDA培养基的生长速度不如前三种培养基,但Monacolin K的合成量较高。营养丰富的培养基促进了菌丝和孢子的积累,营养相对匮乏的培养基有利于次级代谢产物的合成。研究了不同碳源对红曲霉CG-6 Monacolin K合成量的影响,发现甘油最有利于Monacolin K的合成。研究发现,浓度为8%的甘油有利于酸型和内酯型Monacolin K的合成,其中酸型Monacolin K积累量为5957.5 μg/g,总Monacolin K为9474.4 μg/g,酸型Monacolin K占总Monacolin K的63%。同时发现,胞外Monacolin K的量是胞内的70%以上。扫描电镜结果表明,在高浓度的甘油培养基中,红曲霉CG-6菌丝生长密集,孢子产量较少,不利于细胞呼吸。研究了不同氮源对红曲霉CG-6 Monacolin K合成量的影响,发现谷氨酸钠有利于红曲霉CG-6 Monacolin K的合成,但随着谷氨酸钠浓度的增加,逐渐不利于生物量的积累。因此,在选用甘油作为碳源时,需要综合考虑生物量和Monacolin K积累,最终选用酵母粉为氮源,谷氨酸钠为辅助因子,通过正交试验设计,选取8%甘油、1.5%酵母粉、0.5%谷氨酸钠进行验证,Monacolin K总量达到9876.3 μg/g,生物量达到1.35 g/平板。采用优化后的培养基,在发酵产物中未检出桔霉素。通过RT-PCR方法研究发现,甘油可以提高红曲霉CG-6 mokA、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH基因表达量,尤其是mokE基因在发酵初期就高效表达,在发酵后期是对照组的3.4倍。研究了高浓度甘油抑制Monacolin K的合成机理,发现高浓度甘油下调了mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH基因表达量,造成Monacolin K的积累量下降。克隆了与产孢有关基因veA、flbA、laeA、PKA,并研究了发酵过程中veA、flbA、laeA、PKA基因表达量的变化,发现veA、PKA这两个与有性生殖有关的基因表达量一直不高,而参与分生孢子积累的基因flbA表达量呈现先升高后降低,说明分生孢子积累早于Monacolin K的积累;全局调控因子laeA表达量持续升高,表明laeA除参与红曲霉CG-6生长繁殖外还参与其次级代谢产物的积累。