论文部分内容阅读
目的HIF-1α在肝脏纤维化、心肌纤维化等疾病中发挥重要作用,但其在矽肺中的作用以及机制还未被阐明。本研究通过构建实验性小鼠矽肺模型及NIH-3T3细胞体外转分化模型,从不同层次探索HIF-1α在矽肺中的调控作用及其分子机制,为进一步阐明矽肺发病机制提供依据,为探寻有效的矽肺干预手段提供新的思路和参考依据。材料与方法1 主要材料NIH-3T3小鼠肺成纤维细胞购自中国科学院细胞库;雄性、4周龄C57BL/6N小鼠（15～20 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2 研究方法2.1 NIH-3T3细胞体外转分化模型构建及HIF-1α表达变化及其作用机制观察使用不同浓度的TGF-β1处理NIH-3T3细胞建立转分化模型。以Western blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白表达水平,RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α mRNA 表达水平。使用7.5 ng/mL的TGF-β1处理NIH-3T3细胞,在不同时间使用以Western blot 技术检测 α-SMA、COLIA1、HIF-1α 蛋白表达水平,RT-qPCR 检测 α-SMA、COLIA1、HIF-1α mRNA 表达水平。分别使用DMOG、KC7F2、SIS3和HIF-1α/NC-siRNA干预转分化模型。使用 Western blot 技术检测 α-SMA、COLIA1、HIF-1α、SMAD3 及 PSMAD3 蛋白表达水平。RT-qPCR 检测 α-SMA、COLIA1、HIF-1α mRNA 表达水平。2.2 小鼠矽肺模型中HIF-1α的表达变化检测及干预效果观察将40只C57BL/6N小鼠随机分为生理盐水对照组、矽肺模型组、干预对照组以及KC7F2干预组。通过非暴露式气管滴注100 μLSiO2粉尘悬浊液（50mg/mL）建立矽肺模型（生理盐水对照组滴注等量生理盐水）,KC7F2组小鼠按3天一次的频率腹腔注射KC7F2溶液（0.75 mg/kg）,干预对照组小鼠注射等量生理盐水。使用HE和Masson染色评估小鼠肺组织损伤及纤维化程度,使用免疫组化检测小鼠肺组织COLIA1与HIF-1α蛋白表达水平。通过Western blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α、SMAD3 及 PSMAD3 蛋白表达水平。RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α mRNA 表达水平。3 统计学分析实验数据采用SPSS 25.0统计分析,计量资料以均数±标准差表示,两组样本间差异比较采用Student’s t检验,多样本差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。结果1 NIH-3T3细胞转分化模型的构建及HIF-1α作用机制的观察1.1 不同浓度TGF-β1处理对NIH-3T3转分化模型的影响0、2.5、5、7.5、10 ng/mLTGF-β1 处理NIH-3T3 细胞 24h,α-SMA 蛋白及mRNA表达水平、pSMAD3/SMAD3比值在5 ng/mL时显著升高,COLIA1蛋白及mRNA表达水平、HIF-1α蛋白的表达水平在7.5 ng/mL时显著升高,HIF-1αmRNA表达水平未发生改变。1.2 不同时间TGF-β1处理对NIH-3T3转分化模型的影响7.5 ng/mL TGF-β1处理 NIH-3T3细胞 0、2、4、6、8、10、12、24、48h,COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平不断升高;HIF-1α蛋白表达水平与pSMAD3/SMAD3比值先升高后下降,在4h时达到最大值。1.3 干预HIF-1α对NIH-3T3转分化模型的影响与Control组相比,DMOG组中COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平与 pSMAD3/SMAD3 比值升高;KC7F2 组、HIF-1α-siRNA 组 COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平及pSMAD3/SMAD3比值下降。1.4 同时干预HIF-1α与pSMAD3对NIH-3T3转分化模型影响与Control组相比,DMOG组COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平、pSMAD3/SMAD3 比值升高。与 DMOG 相比,DMOG+SIS3 组中 COLIA1、α-SMA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值降低。2 小鼠矽肺模型的建立以及KC7F2干预效果的观察2.1 KC7F2干预HIF-1α表达对矽肺小鼠肺组织病理改变的影响Silica组小鼠肺组织均出现肺泡壁的破坏及增厚、不同程度的炎性聚集、细胞外基质分泌增多等现象,且病变严重处出现细胞结节。与Silica组相比,KC7F2组小鼠肺组织的炎性聚集、浸润程度降低。2.2 KC7F2干预HIF-1α表达对矽肺小鼠肺组织mRNA与蛋白表达水平的影响与 Saline 组相比,Silica 组中 α-SMA、COLIA1、HIF-1α 蛋白及 mRNA 表达水平与pSMAD3/SMAD3比值均明显升高。与Silica组相比,KC7F2组α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白及mRNA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值均降低。结论HIF-1α能够促进SMAD3的磷酸化,促进NIH-3T3细胞转分化为肌成纤维细胞。干预HIF-1α的表达能够抑制实验性小鼠矽肺的肺部损伤与纤维化的发生发展。