研究背景及目的:人类支持细胞是调控精子发生最重要的体细胞,因此,支持细胞的研究是生殖医学和生殖生物学的基础。值得关注的是,支持细胞有着很强的可塑性,支持细胞通过重编程可转变为有功能的其他类型细胞,包括神经干细胞、睾丸间质细胞、分泌胰岛素的细胞等,表明支持细胞在再生医学中有广泛的应用前景。然而,人支持细胞的基础与应用研究却遇到了很多难题:人睾丸组织来源有限导致原代人支持细胞的获取缺乏。基于这一难题,我们在本学位论文中通过过表达人端粒酶基因的方法,建立一种长期增殖和安全性高的人类支持细胞系,这将为人类支持细胞在基础研究及其在生殖医学与再生医学的应用提供大量的细胞来源。方法:慢病毒的包装:将整合了人端粒酶基因的载体和两种辅助包装质粒(△8.9和VSVG)用lipofectamine 3000共转染293T细胞,分别于转染后48小时、72小时收集慢病毒上清。利用两步酶消化和差异贴壁的方法从梗阻性无精子症病人(有正常精子发生)分离出原代人睾丸的支持细胞。然后,包装好的慢病毒用聚凝胺感染原代人支持细胞,通过流式细胞分选术分离表达报告蛋白EGFP的阳性细胞,并对其进行培养扩增。运用RT-PCR、免疫细胞化学、蛋白质印迹等技术对其生化表型进行鉴定;通过细胞增殖实验(CCK-8)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及Ki-67免疫细胞染色等方法对该细胞系的增殖能力进行检测;通过微阵列技术比较人支持细胞系和原代人支持细胞的基因组,分析人支持细胞系与原代支持细胞的大规模基因表达的差异性及相似性。最后,我们对该细胞系的安全性进行评估:利用细胞遗传学方法对该细胞系进行核型分析;采用多重实时荧光定量PCR的方法检测其是否存在Y染色体微缺失;裸鼠皮下成瘤实验检测其是否形成肿瘤。结果:蛋白质印迹显示,我们所构建的细胞系能够在第10代、15代和20代稳定表达人端粒酶蛋白。过表达了人端粒酶基因的细胞系表达原代人支持细胞的多种特异性标志物。在转录水平上,细胞系表达人支持细胞的基因,包括AR、ABP、BMP4、BMP6、CLDN11、GATA4、GDNF、OCLN、SCF、SOX9、WT1和ZO-1,而不表达间质细胞、管周肌样细胞和生殖细胞的基因,分别是3β-HSD、SMA和VASA。在蛋白质水平上,免疫细胞化学显示细胞系为SOX9、WT1、OCLN、VIM、SCF、BMP4、GDNF阳性,而3β-HSD、SMA和VASA为阴性;蛋白质印迹进一步发现,细胞系表达SCF、GDNF、BMP4、WT1和SOX9,并不表达3β-HSD、SMA和VASA。蛋白质印迹可见,人支持细胞系的PCNA蛋白的表达水平与原代人支持细胞相当,免疫细胞化学显示,70%以上的人支持细胞系为ki-67阳性。这些结果表明表明,所构建的人支持细胞系具有良好的增殖能力,它们在体外培养时间长达6个月,已经传了30多代。人支持细胞系不存在Y染色体微缺失,也没有致瘤性,90%的染色体核型正常,提示该细胞系有较好的安全性。结论:我们成功构建了第一株人类支持细胞系,该细胞系的生物学表型和生物学功能与原代人支持细胞相近,并具有在体外无限增殖的能力,该细胞系可为人支持细胞在生殖生物学和再生医学的基础与应用研究提供丰富的细胞来源。