肉类在世界各地人类饮食的构成中占据了重要的地位,但是随着肉类消费需求的快速增长,肉类掺假的现象层出不穷,肉类的质量控制变成了当务之急。猪肉因其价格便宜、颜色和质地与牛肉等肉类相似,从而被不法分子掺入牛肉、羊肉和其他高价肉类的肉制品中。这些恶意行为不仅会影响人们健康,还会造成经济损失和对消费者宗教信仰的严重侵犯。近年来,对猪源性成分的鉴定技术大多局限于实验室操作、依赖贵重仪器或者需要专业人员进行复杂的结果分析,不能满足对肉制品中猪源性成分进行准确、快速鉴定的需求。CRISPR系统作为新型的基因编辑技术,因其系统中的Cas蛋白具有反式切割能力和高度特异性序列识别能力,被人们改造成一种超灵敏的核酸检测工具。目前CRISPR系统已应用于病毒、细菌诊断等领域,但在猪源性成分鉴定方面的研究鲜有报道。本研究旨在利用CRISPR/Cas系统联合环介导等温扩增技术,建立快速检测肉制品中猪源性成分的LAMP-CRISPR/Lb Cas12a系统。本研究取得的主要研究进展如下:1)在CRISPR系统中,具有顺式和反式切割活性的Cas蛋白和高特异性的cr RNA组成二元复合物,与靶标DNA结合后不加选择地切割单链DNA探针,所以Cas蛋白和cr RNA二者缺一不可。为了获得具有顺式和反式切割活性的Lb Cas12a蛋白,构建了p ET30a-Lb Cas12a重组表达载体,成功获得了Lb Cas12a蛋白。通过合成文献中的cr RNA与靶标DNA,验证了自表达的Lb Cas12a蛋白具有顺式和反式切割活性。通过优化最佳反应温度为37℃、CRISPR检测缓冲液中镁离子浓度为80m M、优化Lb Cas12a蛋白与cr RNA的摩尔浓度比为1:2后,本研究构建的Lb Cas12a检测体系可以最低检测到80p M的靶DNA。2)为了构建用于猪源性成分检测的CRISPR/Lb Cas12a系统,首先通过比较几种动物组织DNA试剂盒提取DNA的效率和纯度,选择Tiangen组织基因组DNA提取试剂盒作为猪肉样本的DNA提取试剂盒。通过序列比对,选择线粒体DNA中的cytb基因作为CRISPR/Lb Cas12a系统检测的靶标基因。设计cr RNA并成功验证cr RNA活性后,对猪肉全基因组进行CRISPR/Lb Cas12a检测。然而结果发现,构建的CRISPR/Lb Cas12a检测系统难以实现猪肉全基因组的快速检测,需要通过体外扩增来增大靶标DNA的浓度,从而提高CRISPR/Lb Cas12a系统的灵敏度。3)为了增大靶标DNA浓度,本研究选择LAMP技术来对猪肉线粒体DNA进行扩增。使用Primer Explore V5进行LAMP引物的设计,通过对引物组的初筛,选择C-3、D-1和D-2三套引物组进行LAMP反应体系中镁离子浓度、d NTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度的优化。三组引物最优扩增体系分别为:C-3、D-1和D-2引物组的外引物浓度0.2μM,C-3、D-1引物组的内引物浓度为1.6μM,而D-2引物组内引物浓度为2.0μM;C-3、D-1和D-2引物组的d NTP浓度均为1m M;Mg2+浓度分别为4m M、5m M、4m M;Bst DNA聚合酶终浓度分别为0.4U/μL、0.4U/μL、0.48U/μL。评估三套引物组的特异性和灵敏度,C-3引物组最低可以检测到牛肉中掺入质量比为1%的猪肉,而D-1和D-2引物组均只能检测到10%。但三组引物的特异性较好,这为LAMP-CRISPR/Cas系统的联合检测提供了基础。4)将LAMP技术与CRISPR/Cas系统结合,建立了肉制品中猪源性成分的LAMP-CRISPR/Lb Cas12a检测方法。通过LAMP技术对检测样本DNA进行扩增后,将LAMP产物添加到CRISPR/Lb Cas12a检测系统,即可检测出现明显的荧光信号。为了验证LAMP-CRISPR/Lb Cas12a检测系统的特异性、灵敏度,通过在牛肉中混合不同比例的猪肉,来模拟猪肉掺假模型,C-3和D-1两组的LAMP-CRISPR检测系统分别可检测掺杂在牛肉中0.05%和0.1%的猪肉。综上所述,本研究初步建立了LAMP-CRISPR/Lb Cas12a联合检测肉制品中猪源性成分的方法,该方法可以直接用肉眼观察检测结果,为肉类掺假检测提供了一种新的检测方式。