研究背景脑卒中(stroke),是指由于急性脑循环障碍所致的局限或全面性脑功能缺损综合征。脑卒中作为神经系统的常见病及多发病,受环境及遗传等因素的影响,因其高发病率、高死亡率、高致残率的特点己经成为严重危害人类健康和生命安全的世界性健康问题。脑卒中包括缺血性和出血性脑卒中,其中,85-90%的脑卒中患者为缺血性脑卒中。缺血性脑卒中是指各种原因所致脑部血液供应障碍导致脑组织缺血、缺氧性坏死,出现相应的神经功能缺损。缺血性脑卒中又分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死3种类型。近年来,我国缺血性脑卒中发病比例呈现快速上升势头,除了行为因素,如吸烟、饮酒、摄入过多的热能而造成肥胖、环境污染以及其他不健康的生活方式外,遗传因素不容忽视。双胞胎以及家族聚集性研究表明遗传因素是缺血性脑卒中发病的一个重要原因。Syk (Spleen tyrosine kinase)基因位于人类9号染色体9q22,编码脾酪氨酸激酶,是一种广泛表达在造血细胞的非受体型的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs),在淋巴细胞发展以及免疫细胞活化过程中起着极为重要的作用。Syk基因表达于所有造血系统细胞,其中B细胞呈高水平表达,而在T细胞、血小板以及骨髓细胞中表达水平较低,但是血小板的聚集、释放以及血栓形成等功能却必须依赖Syk的信号转导来实现。目前关于Syk基因启动子区域甲基化与癌症关系的研究己成为国内外的研究热点,研究主要集中在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、急性淋巴细胞性白血病等。研究发现与癌症有关的发病机制主要为Syk基因启动子区域甲基化过度,其表达产物Syk表达下降或缺失,机体免疫细胞发育、成熟障碍,导致机体免疫功能下降,从而对突变,异常增生的细胞失去免疫力,导致肿瘤的发生。研究还发现Syk活性与自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等相关。就国内外的研究现状而言,关于Syk基因的研究主要集中在启动子区域甲基化程度对癌症和自身免疫性疾病的影响上,而从基因突变的角度研究Syk基因对疾病的影响却较少见。直到近年来,才有关于Syk基因多态性与疾病相关的研究报道,如Syk基因多态性与非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌以及前列腺癌等的关联研究。众所周知,损伤血管的止血功能必须依赖血小板的激活与聚集,而血小板的过度聚集同时也是血栓形成、心肌梗塞以及缺血性脑卒中等疾病的诱因。有研究表明,血小板表面的胶原受体膜糖蛋白(GPVI)通过介导Syk酪氨酸磷酸化,从而使下游的信号转导级联扩大,最终引起大量血小板的激活与聚集。此外,C型凝集素样受体2 (CLEC-2)是一种专一性的血小板受体,能通过src家族蛋白激酶(SFKs)和Syk依赖的蛋白激酶磷酸化引起大量的血小板激活以及聚集。因此,Syk的活性可能与缺血性心脑血管疾病存在某种关联。此外,也有研究发现Syk基因与动脉粥样硬化形成存在极大的相关性。近年来,有研究报道Syk基因的表达量下降可能与家族聚集性缺血性脑卒中的发病有关。本研究课题组前期基于全基因组外显子测序技术研究中发现,Syk基因rs2290890多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中的发病相关。因此,Syk基因进入到我们的研究视野。明确Syk基因多态性在亚洲人群特别是中国汉族人群缺血性脑卒中发病过程中的作用将有重大意义。研究目的探讨Syk基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中发病的关联,分析“基因—环境”的交互作用对缺血性脑卒中发病的影响,为缺血性脑卒中在遗传病因学的研究提供依据和思路。材料与方法本研究采用以医院为基础的病例对照研究方法,从深圳市3家三甲医院神经内科中选择缺血性脑卒中患者作为研究病例。所有研究病例均为中国汉族人群,且为首发病例。缺血性脑卒中病例是根据中华神经科学会第四届全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点(1995)》作为诊断标准,由经验丰富的神经内科医师参考临床表现、CT或MRI等辅助检查而确诊。排除标准为既往患有缺血性和／或出血性脑卒中、脑肿瘤、脑挫伤和脑部手术史患者,以及有严重疾病如严重慢性阻塞性外周动脉性疾病、严重自身免疫性疾病、严重心脏病以及曾做过心脏手术等患者。对照组来源于相同医院的体检中心常规健康体检的中国汉族健康人群,对照组的年龄、性别与病例组匹配,排除标准与病例组相同。由调查员使用统一的调查表记录所有研究对象的人口统计学资料和临床资料,包括年龄、性别、身高、体重、既往病史(脑部疾病、高血压、糖尿病、心脏病)、吸烟史、饮酒史以及血脂水平(TC、TG、HDL-c、LDL-c)等。课题组使用PASS样本量估计软件代入相关参数(α=0.05,β=0.1,OR=1.5, MAF=0.122),得出样本量需要728对,而本次研究中实际共纳入1400对研究对象。所有研究对象均于清晨空腹抽取约3-5m1外周静脉血,收集于含有EDTA的抗凝管中,并上下混匀。利用血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA,并置于-80℃保存待进行基因分型。本课题组前期在HapMap数据库中选择了Syk基因功能编码区、最小等位基因频率(MAF)大于0.1的8个单核苷酸多态性(SNP)位点进行500对中国汉族人群中等样本的研究,发现3个SNP位点rs2306040(T/C)、rs1049164(G/A)和rs290986(A/G)多态性与缺血性脑卒中发病存在相关性。现对这3个位点多态性与缺血性脑卒中的关系进行大样本的验证。针对上述3个SNPs,利用Real-time PCR7500仪器,采用Taqman探针技术进行实时荧光定量PCR以明确基因分型。随机抽取10%的样本进行重复测量分型,以保证分型结果的准确性。经对比,一致性达到99%。SPSS20.0用于进行统计学分析,连续性变量使用两独立样本t检验或方差分析进行统计学分析,分类变量使用χ2检验或Fisher确切概率检验进行分析。利用多元logistic回归模型分析基因多态性及环境因素与缺血性脑卒中的关系,校正因素包括年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、心脏病、吸烟以及饮酒等。Haploview4.2软件用于对基因位点间单体型分析。所有统计学分析以P<0.05为差异有统计学意义。结果共有1355名病例和1363名对照成功参与该研究。病例组的平均年龄为59.84±10.93岁,对照组的为58.71±10.44岁,两组年龄分布差异无统计学意义(P=0.063)；病例组女性有861人,占63.5%,对照组为852人,占62.5%,两组性别分布差异无统计学意义(P=0.665)。临床特征方面,高血压和糖尿病发病比例、饮酒史比例、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白脂固醇以及低密度脂蛋白胆固醇水平在两组中的分布差异均有统计学意义(P<0.05)Syk基因多态性与临床指标的关联性方面,rs2306040显性效应模型表明,携带C等位基因基因型(CC和CT基因型)的个体糖尿病发病比例高于TT基因型携带者(P=0.023)。对于rs1049164,BMI指数和HDL-c水平在不同的突变基因型与GG野生基因型携带者间差异均有统计学意义(P<0.05)。对于rs290986,不同突变基因型携带者与AA野生基因型携带者间BMI指数、总胆固醇水平及糖尿病发病比例差异均有统计学意义(P<0.05)。Syk基因多态性与IS关联性,在对照组中3个SNP基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。对于rs2306040,经校正分析后,与TT基因型携带者比较,CT基因型携带者有更高的缺血性脑卒中发病风险(OR=1.23,95%CI=1.01-1.48, P=0.037);显性效应模型分析发现,携带C等位基因基因型(CT基因型和CC基因型)比TT基因型携带者有更高的IS发病风险(OR=1.24,95%CI=1.03-1.49, P=0.022);加性效应模型分析发现,在加性模型条件下有更高的IS发病风险(OR=1.19,95%CI=1.02-1.38, P=0.023);等位基因分析发现,与T等位基因相比,C等位基因携带者有更高的IS发病风险(OR=1.19,95%CI=1.02-1.38, P=0.023)。对于rs1049164,经校正分析后,AA基因型携带者比GG基因型携带者有更高的IS发病风险(OR=2.58, 95%CI=1.37-4.85, P=0.003);加性效应模型分析表明,在加性模型条件下有更高的IS发病风险(OR=1.21,95%CI=1.01-1.47, P=0.046);隐性效应模型分析发现,AA基因型携带者比GG基因型和GA基因型携带者有更高的IS发病风险(OR=2.56,95%CI=1.36-4.81, P=0.003);等位基因分析发现,与G等位基因相比,A等位基因携带者有更高的IS发病风险(OR=1.24,95%CI=1.02-1.52, P=0.035)。对于rs290986,该位点多态性与IS发病没有统计学关联(P>0.05)。分层分析与交互作用分析方面,为了控制相关因素的混杂影响,我们对年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟以及饮酒进行了分层。对于rs2306040, CT基因型携带者,在年龄大于59岁、女性、不饮酒人群有更高的IS发病风险,OR值分别是1.44 (95%C1=1.09-1.90)、1.45 (95%CI=1.06-1.99)、1.28 (95%CI=1.03-1.59)。CC基因型携带者,在年龄大于59岁、男性人群有更高的IS发病风险,OR值分别是1.81 (95%CI=1.01-3.23)、1.82 (95%CI=1.08-3.06).加性效应模型分析发现,在年龄大于59岁、男性、无糖尿病、吸烟人群中有更高的IS发病风险,OR值分别是1.39 (95%CI=1.12-1.73)、1.21 (95%CI=1.01-1.47). 1.18 (95%CI=1.01-1.39)、1.38 (95%CI=1.06-1.81).显性效应模型分析表明,在年龄大于59岁、无糖尿病、吸烟及不饮酒人群中有更高的IS发病风险, OR值分别是1.49 (95%CI=1.14-1.94)、1.22 (95%CI=1.01-1.49)、1.45 (95%CI=1.04-2.02)、1.26 (95%CI=1.03-1.55)。隐性效应模型分析也发现,在男性人群中有更高的IS发病风险(OR=1.75,95%CI=1.05-2.92)。交互作用分析发现,该位点基因多态性与年龄对IS发病的影响存在交互作用(P=0.006)。对于rs1049164, AA基因型携带者在年龄大于59岁、男性、无高血压病史、无糖尿病病史、不吸烟及不饮酒人群中有更高的IS发病风险,OR值分别是5.10 (95%CI=2.10-12.36)、2.61 (95%CI=1.25-5.44)、2.88 (95%CI=1.30-6.39)、 2.37 (95%CI=1.21-4.64)、3.11 (95%CI=1.40-6.89)、3.08 (95%CI=1.43-6.65)。加性效应模型分析发现,在年龄大于59岁、无糖尿病病史、不吸烟及不饮酒人群有更高的IS发病风险,OR值分别是1.61 (95%CI=1.23-2.10)、1.23 (95%CI=1. 00-1.51)、1.35 (95%CI=1.07-1.71)、1.27 (95%CI=1.02-1.58)。显性效应模型分析发现,在年龄大于59岁人群有更高的IS发病风险(OR=1.55,95%CI=1.12-2.14)。隐性效应模型分析也显示,在年龄大于59岁、男性、无高血压病史、无糖尿病病史、不吸烟及不饮酒人群有更高的IS发病风险,OR值分别是4.88(95%CI=2.02-11.81)、2.63 (95%CI=1.27-5.47)、2.84 (95%CI=1.29-6.28)、2.33 (9 5%CI=1.19-4.56)、3.02 (95%CI=1.36-6.68)、3.05 (95%CI=1.42-6.56)。交互作用分析发现该位点基因多态性与年龄对IS发病的影响存在交互作用(P=0.001)。Syk基因多态性与血脂水平对IS发病影响的累积效应分析方面,虽TC和TG水平在两组中差异有统计学意义,但两者在病例组的水平低于对照组,所以排除TG和TC,只选择HDL-c和LDL-c进行累积效应分析。我们将对照组HDL-c和LDL-c平均水平(1.22mmol/L和3.02mmol/L)为界线分为两组,发现对于rs2306040, HDL-c氐于1.22mmol/L与携带C等位基因的基因型(CT基因型和CC基因型)两者间对IS发病影响存在累积效应(OR=1.95,95%CI=1.41-2.69),而LDL-c高于3.02mmol/L与携带C等位基因的基因型(CT基因型和CC基因型)两者间对IS发病影响存在累积效应(OR=2.30,95%CI=1.66-3.18).对于rs 1049164, HDL-c低于1.22mmol/L与AA基因型携带者两者间对IS发病的影响存在累积效应(OR=4.50,95%CI=2.07-9.77)。单体型分析方面,对Syk基因的rs2306040与rs1049164两个位点进行单体型分析,因两位点之间存在很低的连锁不平衡(r2=0.009,D’=0.469),构造的LD模块无统计学意义(P>0.05)结论1.Syk基因rs2306040(T/C)多态性与IS发病风险有关联CT基因型携带者或C等位基因携带者发生IS的风险比TT基因型携带者高。2.Syk基因rs1049164(G/A)多态性与IS发病风险有关联AA基因型携带者或A等位基因携带者发生IS的风险显著比GG基因型携带者高,AA基因型携带者发生IS的风险比GA+GG基因型携带者高。3.Syk基因的rs2306040和rs1049164多态性与年龄对IS发病风险的影响存在交互作用4.Syk基因的rs2306040和rs1049164多态性与HDL-c/LDL-c对IS发病风险的影响存在累积效应。5.Syk基因rs290986(A/G)多态性与IS发病风险没有关联。6.Syk基因多态性有望成为预测IS遗传易感性的生物标记物。