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过氧亚硝酸根(ONOO-)是由生物体内的一氧化氮自由基和超氧阴离子快速反应生成的一种具有强氧化和硝化能力的细胞毒性物质。ONOO-会诱导氨基酸残基的硝化、蛋白质生物活性的改变、脂质的过氧化和DNA链的断裂等,导致细胞的凋亡,从而诱发一系列病变。血浆中含量最丰富和结合能力最广泛的是血清白蛋白,它在血液渗透压的维持、血小板聚集的抑制和自由基的清除等方面具有重要生物功能。血清白蛋白结构的损坏和功能的缺失会引起生物体内转运、存储和代谢等功能的异常,导致生命活动的异常,产生严重的疾病。然而,据有关研究报道,体内环境中与二氧化碳处于动态平衡的碳酸氢盐(25 mM左右)会影响ONOO-对蛋白质的损伤作用,改变ONOO-在体内的毒理性质。 本论文以脯氨酸(Pro)、牛血清白蛋白(BSA)为研究对象,ONOO-为诱导剂,结合生物体内微环境,运用紫外-可见分光光度计、高效液相色谱、电喷雾离子阱质谱和停流动力学装置等生化分析仪器,研究了二氧化碳对ONOO-自分解、脯氨酸的结构损伤和BSA生物活性的改变等方面的影响。ONOO-和Pro/BSA反应产物的光谱研究结果表明二氧化碳的存在会影响ONOO-的损伤作用,使得ONOO-的生物毒性减弱或改变。25 mM二氧化碳仿生体系下ONOO-对Pro和BSA的损伤抑制率最大分别达到30.65%和52.17%。通过对硝化浓度和反应体系的生理模拟,经过大量实验的摸索,优化了产物分离的条件,使氨基酸/蛋白质损伤产物的色谱分离效果达到最优,之后对反应产物进行定性和定量分析,确定氧化或硝化位点的优先顺序,初步阐明了ONOO-的硝化损伤机理。然后对ONOO-与二氧化碳快速反应动力学进行分析,得到反应的速率常数为1.0778×103 M-1·s-1。 根据叶酸对BSA内源荧光会产生猝灭的现象,还对仿生环境下叶酸修饰BSA的机制和动力学方面做了相关研究。利用Stern-Volmer方程处理荧光猝灭数据,得到25、30和37℃下BSA的荧光猝灭常数分别为2.455×1010、4.900×1010和6.427×1010 L·mol-1·s-1。叶酸和BSA的结合是一个正向自发过程,主要以静电作用力通过1个结合位点形成复合物的静态猝灭过程。此外,叶酸和BSA反应的动力学分析,证实了该反应属于二级反应,生理温度下的药代半衰期t1/2为0.059 s和反应速率常数为3.174×1O5 M-1·s-1。在实验研究的基础上,动力学曲线分析得到不同仿生环境下BSA与叶酸的反应速率。结果表明,水溶液下的反应速率比生理介质NaCl和CO2溶液中的速率大15.7%和9.3%;研究的多种金属离子中只有Fe3+、Cu2+和Mn2+三种金属离子会和叶酸产生协同猝灭作用,改变反应的作用力类型和体系焓变ΔH值。 本研究利用现代分析技术鉴定了不同仿生环境下ONOO-损伤脯氨酸的硝化位点及其对蛋白质活性的影响,并结合动力学分析了ONOO-损伤氨基酸和蛋白质与叶酸相互作用的机理,有助于进一步探讨ONOO-损伤蛋白质并引发癌症产生的机理,为预防癌症和药物开发提供一定的理论基础。