论文部分内容阅读
第一部分 靶向盘状结构域受体（DDR）1基因的短发夹RNA重组质粒的构建与转染目的构建靶向盘状结构域受体（DDR）1基因的短发夹RNA（shRNA）重组质粒,转染到前列腺癌细胞方法培养前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145细胞三种细胞株,采用RT-PCR和Western blot技术检测细胞中DDR1 mRNA和蛋白的表达情况,选取DDR1表达水平最高的细胞株用于后续研究。根据DDR1的基因序列利用软件Pre-designed siRNA设计针对DDR1 mRNA的shRNA序列,应用BLAST软件分析各序列的二级结构及同源性,从中筛选3条序列分别与质粒载体连接构建重组质粒,序列验证正确后转染DDR1表达水平最高的前列腺癌细胞,通过RT-PCR和Western blot检测DDR1表达并选择抑制效率最高的重组质粒,获得稳定转染的细胞株。结果前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145细胞中均存在DDR1 mRNA的表达,PC-3细胞中DDR1 mRNA的相对表达水平（0.233±0.09）高于DU145细胞（0.169±0.03）及LNCaP细胞（0.147±0.05）（P＜0.05）;前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145 细胞中均存在DDR1蛋白的表达,PC-3细胞中DDR1蛋白的相对表达水平（0.767±0.29）高于DU145 细胞（0.347±0.19）及LNCaP细胞（0.221±0.13）（P＜0.05）,以上结果表明前列腺癌PC-3细胞中DDR1的mRNA和蛋白的表达水平最高。采用酶切和测序法证实pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA1、pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA2、pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA3 重组质粒均构建成功,符合实验要求。前列腺癌PC-3细胞分为5组,分为阴性对照,空质粒及 pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA1、pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA2、pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA3重组质粒组,前列腺癌PC-3细胞内DDR1 mRNA的相对表达水平分别为:0.299±0.09、0.324±0.11、0.058±0.02、0.189±0.01与0.114±0.02,差异有统计学意义（P＜0.05）;DDR1蛋白的相对表达水平分别为 0.612±0.19、0.688±0.29、0.107±0.03、0.362±0.15 和 0.235±0.17,差异有统计学意义（P＜0.05）;表明三种重组质粒均可抑制前列腺癌PC-3细胞中DDR1基因mRNA和蛋白的表达,其中重组质粒pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA1的抑制效率最高。结论前列腺癌PC-3细胞中DDR1表达最高。成功构建了抑制DDR1表达的重组质粒,其中重组质粒pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA1抑制细胞内DDR1表达的效率最高。第二部分 抑制DDR1表达对前列腺癌的生物学行为的影响目的观察抑制DDR1基因表达后前列腺癌的生物学行为变化并检测细胞内影响其细胞生物学行为的相关分子表达。方法将重组质粒pGPH1/GFP/Neo-DDR1-shRNA1转染前列腺癌PC-3细胞（实验组）,以未转染和转染pGPH1/GFP/Neo质粒的细胞分别作为阴性对照组和空质粒组。采用RT-PCR、Western blot和免疫组化检测细胞内DDR1 mRNA和蛋白的表达,采用流式细胞仪和Transwell小室技术检测前列腺癌PC-3细胞的凋亡及迁移能力的变化,记录并绘制细胞的生长曲线,采用RT-PCR和Western blot法检测前列腺癌PC-3细胞中PI3K含量。制备前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤模型,分别以注射重组质粒、空质粒和PBS的移植瘤小鼠作为实验组、阴性对照组和空白组。观察瘤体的生长情况,应用RT-PCR和Western blot技术检测瘤组织中DDR1的表达以及MMP-2、Bax及PCNA的表达。结果质粒转染48 h后,实验组PC-3细胞中DDR1 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组和空质粒组降低（P＜0.05）。阴性对照组、空质粒组与实验组PC-3细胞中PI3K mRNA 的相对表达水平分别为 0.608±0.21、0.555±0.020 和 0.192±0.015,PI3K蛋白的相对表达水平分别为0.575±0.23、0.496±0.22和0.175±0.05,实验组PI3K mRNA和蛋白的表达水平均低于与阴性对照组和空质粒组,差异有统计学意义（P＜0.05）。转染重组质粒后计数培养不同时间（48h、72h及96h）后的细胞数量,可见实验组前列腺癌PC-3细胞增殖速度低于阴性对照组及空质粒组（P＜0.05）。实验组穿透Transwell小室的细胞数（9.4±1.2/HP）少于阴性对照组（19.6±5.6/HP）和空质粒组（21.5±7.1/HP）（P＜0.05）;实验组细胞的凋亡率（10.52±3.1）%高于阴性对照组（5.23±1.8）%和空质粒组（4.88±2.2）%（P＜0.05）。动物实验结束时实验组肿瘤体积（352±75）mm3小于阴性对照组（928±257）mm3和空质粒组（1042±243）mm3（P＜0.05）。实验组瘤体组织中DDR1 mRNA的相对表达量（0.078±0.02）低于阴性对照组（0.268±0.06）、空质粒组（0.245±0.08）,蛋白的相对表达量（0.128±0.02）低于阴性对照组（0.268±0.06）、空质粒组（0.295±0.13）（P＜0.05）。实验组PCNA及MMP-2的蛋白均低于低于阴性对照组和空质粒组（P＜0.05）;实验组Bax的相对表达量高于阴性对照组和空质粒组。结论重组质粒转染前列腺癌PC-3细胞可抑制其DDR1的mRNA及蛋白的表达,同时使细胞的增殖受到抑制、凋亡增加、侵袭能力下降。应用重组质粒可抑制裸鼠移植瘤瘤组织内DDR1的表达、减缓瘤体的生长速度,同时下调瘤组织内PCNA及MMP-2表达、上调Bax表达。第三部分 前列腺癌患者癌组织中DDR1表达与患者预后的关系目的探讨前列腺癌患者癌组织中DDR1表达与患者的预后的关系。方法采用免疫组化法检测219例前列腺癌和56例良性前列腺增生组织中DDR1的表达,分析其表达水平与患者预后的关系。结果前列腺癌组织中DDR1蛋白的阳性表达率为79.9%,前列腺增生组织中DDR1蛋白的表达阳性率为10.7%,两者之间差异有统计学意义（P＜0.001）。DDR1的表达阳性率与患者总PSA、Gleason评分、肿瘤分期以及骨转移或淋巴结转移相关（χ2=9.096,P=0.003;χ2=6.997,P=0.030;χ2=5.975,P=0.015:χ2=5.150,P=0.023和χ2=5.738,P=0.017）,与患者年龄、前列腺体积、有无LUTS症状、TURP手术史及去势手术史无关（χ2=0.067,P=0.796;χ2=0.455,P=0.500;χC2=0.058,P=0.809;χ2=2.146,P=0.143和χ2=0.381,P=0.537）。前列腺癌患者的骨转移、临床分期以及Gleason评分与DDR1蛋白的表达水平呈正相关（r=0.199、0.298和0.325,均P＜0.05）。Kaplan Meier单因素回归分析结果显示患者预后与DDR1蛋白表达水平相关,Cox多因素回归分析发现临床分期、Gleason评分、骨转移、淋巴结转移以及DDR1的蛋白表达水平与前列腺癌患者预后密切相关。结论DDR1表达与前列腺癌的恶性程度相关,可作为评估前列腺癌患者预后的指标。