研究背景胃癌（gastric cancer,GC）是全球常见的恶性肿瘤,也是癌症相关死亡主要疾病之一。据2020年全球癌症统计,全球新增癌症病例1930万例,癌症相关死亡为1000万例,胃癌发病率排名第五;胃癌的发病率为5.6%,死亡率为7.7%。通过对其更多的认知、更早的发现和联合治疗方案,胃癌患者的生存得到了一定的改善,但仍有一部分患者最终会因为复发转移而去世。因此,寻找新的胃癌靶向基因和探索其具体转移机制迫在眉睫。目前表观遗传的研究在胃癌中的研究已比较充分,最常见的表观遗传修饰包括胞嘧啶残基上的DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA表达、染色质结构重塑以及核小体定位。其中组蛋白修饰主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。泛素-蛋白酶体途径是一种重要的蛋白降解调控系统,去泛素化是一种由去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）催化的蛋白修饰过程。据报道,人类基因编码的DUBs大约有100多个,并根据其泛素-蛋白酶结构域被分为6个亚类。泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases,USPs）是DUBs中最大的亚类。而去泛素化特异性蛋白酶8（ubiquitin-specific proteases 8,USP8）是USPs家族中的一员。USP8,又称泛素异肽酶Y（ubipy）,是一种半胱氨酸去泛素化酶,属于USPs家族。目前已有大量研究报道,USP8的突变可导致表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）去泛素化增加,使其下调并维持EGF信号通路。USP8与癌症的关系也得到了广泛的研究其在大多数肿瘤中的高表达与患者不良预后相关。然而,USP8只在少数肿瘤中进行了研究,其中可能有更有价值的信息。因此,了解这些变化可能对胃癌的诊断、治疗和预测预后至关重要。本课题旨在探索USP8在胃癌发生发展中的机制,从以下四个部分进行研究:第一部分:转录组学和蛋白质组学分析USP8对胃癌细胞调控的靶基因;第二部分:USP8、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER-2）和人表皮生长因子受体 3（human epidermal growth factor receptor 2,HER-3）在胃癌组织中的表达及其与临床预后的关系;第三部分:USP8抑制剂抑制HER-2阳性胃癌细胞的增殖和侵袭及机制研究;第四部分:下调USP8抑制HER-3阳性胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及机制研究。第一部分 转录组学和蛋白质组学分析USP8对胃癌细胞调控的靶基因目的探索USP8在胃癌细胞中可能调控基因,为USP8对胃癌的调控机制提供理论和实验基础。方法1.采用 Western blot 技术检测 USP8 在 NCI-N87、MKN-45、AGS、BGC-823、HGC-27和MGC-803胃癌细胞系中的表达水平;2.采用MTT法测定USP8抑制剂对胃癌细胞系的半数抑制率（IC50）;3.采用细胞转录组学技术检测USP8对胃癌细胞调控的靶基因;4.采用细胞蛋白质组学技术检测USP8对胃癌细胞调控的靶蛋白;5.对转录组学结果和蛋白组学结果行关联分析和蛋白-蛋白STRING相互作用分析。结果1.USP8 在 NCI-N87、MKN-45、AGS、BGC-823、HGC-27 和 MGC-803 胃癌细胞中均有较高的表达,且在各个细胞中的表达无明显差异性;2.USP8 抑制剂（DUBs-IN-2）可以明显抑制 MKN-45、NCI-N87、和 AGS胃癌细胞增殖,IC50均小于1 μmol/L,且MKN-45细胞最为明显,IC50=0.423μmol/L;USP8抑制剂对MGC-803、HGC-27和BGC-823胃癌细胞抑制不明显,IC50 均大于 4μmol/L;3.转录组学共检测到差异性基因1280个,上调基因1014个,下调基因266个。以倍数变化大于2倍（上调倍率＞2或下调倍率＜0.5）,且P＜0.001的标准筛查差异表达基因,抑制剂组和正常对照组总差异表达基因数量为1001个,其中上调基因792个,下调基因209个;4.蛋白质组学一共鉴定到6098个蛋白质,其中5922个蛋白质包含定量信息。其中共检测到差异性蛋白1280个,上调蛋白1014个,下调蛋白266个。以倍数变化大于1.2倍（上调倍率＞1.2或下调倍率＜1/1.2）,且P＜0.001的标准筛查差异表达基因,抑制剂组和正常对照组总差异表达蛋白数量为299个,其中上调蛋白197个,下调蛋白102个;5.本研究通过转录组与蛋白质组学研究得到分别定量到31885个转录本和6098个蛋白,通过比较转录组与蛋白组的定量情况,有6034个基因在转录组和蛋白组水平都定量,其中有差异性的基因和蛋白有1460个;二者共同下调的靶点共有7个,共同上调的靶点有17个;STRING分析,结果显示USP8与布鲁姆解旋酶（bloomhelicase,BLM）、HER-2和HER-3直接相关,而USP8抑制剂处理后的胃癌细胞,转录组和蛋白组的测序结果均显示出HER-2和HER-3被显著下调（P＜0.05）。小结本部分研究揭示了 USP8基因可靶向调控多个胃癌基因,其中靶基因HER-2和HER-3尤为显著,但仍需进一步研究验证。第二部分 USP8、HER-2和HER-3在胃癌组织中的表达及其与临床预后的关系目的检测胃癌患者石蜡标本中USP8、HER-2和HER-3的表达水平;探讨USP8、HER-2和HER-3与胃癌病人生存预后关系。方法1.收集88例胃癌患者癌组织及配对癌旁组织,应用免疫组化法检测USP8、HER-2和HER-3的表达水平,应用Aperio image Analysis软件分析给予免疫组化评分,并采用Wilcoxon秩和检验对USP8、HER-2和HER-3在癌组织及配对癌旁组织的表达进行差异分析;采用GEPIA数据库验证USP8、HER-2和HER-3在癌组织及癌旁组织的表达差异情况;2.收集胃癌患者相关临床资料,应用χ2检验分析USP8、HER-2和HER-3的表达和临床之间的相关性;3.采用Kaplan-Meier法进行生存分析,Log-rank检验比较USP8、HER-2及HER-3表达高低与患者生存率的差异;4.采用Pearson相关分析判断USP8与HER-2及HER-3表达水平的相关性;5.采用Cox风险比例回归模型进行胃癌患者预后的单因素和多因素生存分析,以确定胃癌患者生存预后的独立影响指标。结果1.USP8、HER-2和HER-3在胃癌组织中的表达值均高于癌旁组织（P＜0.001）;GEPIA数据库分析结果同样显示USP8、HER-2和HER-3在胃癌组织中的表达相对较高的趋势;2.胃癌组织中USP8高表达与区域淋巴结转移和pTNM分期具有相关性（P＜0.05）,其中区域淋巴结有转移较无淋巴结转移患者USP8高表达率高,pTNM分期Ⅰ+Ⅱ患者较Ⅲ者表达率高;胃癌组织中HER-2的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤分化程度、Lauren分型、肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、脉管癌栓、神经侵犯以及pTNM分期等均无相关性（P＞0.05）;胃癌组织中HER-3高表达与神经侵犯、区域淋巴结转移和pTNM分期具有相关性（P＜0.05）;3.Kaplan-Meier生存曲线表明USP8、HER-2和HER-3高表达患者生存时间明显短于低表达患者生存时间（P值分别为0.009,0.001和0.018）;USP8与HER-2、HER-3联合检测在胃癌预后中的作用分析结果表明HER-2和USP8组中二者共低表达患者生存率明显高于二者共高表达组（P=0.006）,HER-3和USP8组中二者共同低表达患者预后较好,共高表达组预后最差（P=0.010）;4.Pearson相关分析显示,胃癌组织中USP8和HER-2的表达显著正相关（R2=0.423,P＜0.001）,胃癌组织中USP8和HER-3的表达显著正相关（R2=0.640,P＜0.001）;5.Cox风险比例回归模型对88例胃癌患者临床指标分析,单因素分析结果显示,男性患者、Lauren混合型、pTNM Ⅲ期、USP8高表达、HER-2高表达以及HER-3高表达参与影响了胃癌患者的总生存时间和总生存率,相对危险度（RR）分别为:3.713、2.678、280.714、4.967、3.434 和 4.049。多因素综合分析,结果表明USP8高表达、HER-2高表达以及HER-3高表达仍可以作为胃癌患者预后的独立指标,RR分别为:5.409、3.110和4.524。小结本部分临床胃癌标本的实验结果表明USP8、HER-2和HER-3可作为胃癌预后的独立影响因素;USP8与HER-2和USP8与HER-3两组蛋白在胃癌中的表达均呈正相关,且二者共高表达均与胃癌患者较差预后相关。第三部分 USP8抑制剂抑制HER-2阳性胃癌细胞的增殖和侵袭及机制研究目的在第一、二部分基础上进一步探索USP8调控HER-2进而影响胃癌进展中的作用及机制。方法1.采用Western blot技术检测HER-2在胃癌细胞系中的表达情况;2.采用MTT法检测USP8抑制剂对胃癌抑制的IC50值;3.通过体内动物实验检测USP8抑制剂对胃癌生长情况的影响,并对异种移植瘤行免疫组化检测HER-3和Ki-67的表达;4.采用克隆形成实验和Transwell实验检测USP8抑制剂对胃癌增殖和侵袭的影响;5.采用浓度梯度实验、半衰期实验、免疫荧光和免疫共沉淀实验检测在胃癌细胞中USP8抑制剂调控HER-2的机制。结果1.在 NCI-N87、MKN-45、AGS、BGC-823、HGC-27 和 MGC-803 胃癌细胞株中,HER-2仅在NCI-N87中高表达;2.USP8抑制剂对NCI-N87的抗增殖作用显著高于MGC-803（P＜0.001）,且 IC50 分别为:0.78μmol/L（NCI-N87）,12.40 μmol/L（MGC-803）;3.USP8抑制剂明显抑制NCI-N87细胞的肿瘤生长,但未能抑制MGC-803的生长（P＜0.05）,同样,随着时间变化,与MGC-803相比,NCI-N87小鼠的肿瘤体积受到了显著抑制（P＜0.05）;异种移植瘤免疫组化结果显示USP8抑制剂对NCI-N87中HER-2和Ki-67的表达明显低于对照组（P＜0.05）,而在MGC-803小鼠异种移植瘤中HER-2和Ki-67的表达无明显变化（P＞0.05）;4.克隆形成实验显示,与MGC-803相比,USP8抑制剂显著抑制了 NCI-N87细胞的增殖（P＜0.01）;Transwell实验结果显示,加入抑制剂的NCI-N87细胞的侵袭能力显著降低（P＜0.05）,而MGC-803细胞并没有受到影响;5.随着USP8抑制剂浓度的增加,HER-2的表达逐渐降低,同样,HER-2的mRNA水平随着USP8抑制剂浓度的增加也逐渐降低;USP8抑制剂和si-RNA处理的NCI-N87细胞,并行CHX处理,6h后,与对照组相比,NCI-N87细胞中HER-2蛋白几乎完全降解;免疫荧光检测结果显示USP8与HER-2共定位于NCI-N87细胞,而MGC-803中未发现HER-2荧光,USP8抑制剂处理后,泛素荧光强度显著增加,HER-2降低,而MGC-803没有改变;USP8和HER-2的IP实验结果显示在NCI-N87细胞中USP8可与HER-2直接结合,USP8抑制剂处理和si-RNA沉默处理后的NCI-N87细胞的泛素化水平均显著增高。小结本部分研究发现USP8抑制剂可抑制HER-2阳性胃癌细胞的增殖和转移,USP8可能成为HER-2阳性胃癌的一种新的潜在治疗生物标志物。第四部分 下调USP8抑制HER-3阳性胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及机制研究目的在第一、二部分基础上进一步探索下调USP8调节HER-3在胃癌进展中的作用及机制。方法1.采用Western blot技术检测HER-3在胃癌细胞系中的表达情况;2.采用克隆形成实验检测下调USP8对胃癌增殖的影响;3.采用细胞划痕和Transwell实验检测下调USP8对胃癌迁移和侵袭的影响;4.采用浓度梯度实验、半衰期实验检测下调USP8对HER-3表达的影响;5.采用流式细胞周期和凋亡实验检测下调USP8对HER-3阳性胃癌细胞的影响;6.采用免疫荧光和免疫共沉淀实验检测在胃癌细胞中下调USP8调控HER-3的机制;7.通过体内动物实验检测下调USP8对胃癌生长情况的影响,并对异种移植瘤行免疫组化检测HER-3和Ki-67的表达;8.采用Western blot技术检测下调USP8与胃癌细胞中的PI3K/Akt信号通路的关联。结果1.在 NCI-N87、MKN-45、AGS、BGC-823、HGC-27 和 MGC-803 胃癌细胞株中,HER-3在NCI-N87、MKN-45和AGS中高表达;2.克隆形成实验结果显示,在不表达HER-3的MGC-803细胞中USP8抑制剂组与对照组以及si-USP8组与对照组均无显著变化;而在AGS和MKN-45两株细胞中（HER-3阳性胃癌细胞）,使用抑制剂和si-RNA均可显著抑制其增值（P＜0.05）;3.细胞划痕实验观察了下调USP8对MGC-803、AGS和MKN-45细胞的迁移的影响,我们观察到下调USP8对胃癌细胞MGC-803的迁移能力无明显影响,而下调USP8能明显抑制AGS和MKN-45胃癌细胞株的迁移能力;Transwell结果显示,下调USP8对胃癌细胞MGC-803的侵袭能力无明显影响,而下调USP8能明显抑制AGS和MKN-45胃癌细胞株的侵袭能力;4.随着USP8抑制剂浓度的增加,HER-3在NCI-N87和MKN-45中的表达水平均逐渐降低,同样,二者HER-3的mRNA水平随着也逐渐降低;下调NCI-N87和MKN-45细胞中的USP8后,实行CHX处理,6h后,与对照组进程相比,NCI-N87和MKN-45细胞中HER-3蛋白几乎完全降解;5.下调USP8可以显著抑制AGS的细胞周期,阻断其G1期,但MGC-803没有受到影响;下调USP8能显著促进NCI-N87和MKN-45细胞的凋亡,但对MGC-803细胞没有影响;6.免疫荧光检测结果显示USP8与HER-3共定位于MKN-45和AGS细胞,而MGC-803中未发现HER-3荧光。下调USP8后,泛素的荧光强度显著增加,HER-3荧光降低,而MGC-803没有改变;USP8和HER-3的IP实验结果显示在NCI-N87和MKN-45胃癌细胞中USP8可与HER-3直接结合,USP8抑制剂处理后和si-RNA沉默处理后的NCI-N87和MKN-45胃癌细胞的HER-3泛素化水平均显著增高;7.MGC-803组的各组小鼠的肿瘤大小、体重、肿瘤重量均无显著变化,而在NCI-N87和MKN-45组中,与空白对照组相比,抑制剂组小鼠的肿瘤生长显著减慢,肿瘤重量显著减少,此外,各组小鼠的生长均无明显影响;小鼠瘤免疫组化结果显示HER-3和Ki-67的表达在NCI-N87和MKN-45异种移植瘤的USP8抑制剂组明显低于对照组,而在MGC-803组中HER-3个和Ki-67没有显著变化。8.下调NCI-N87细胞中的USP8使得E-cadherin表达增加,N-cadherin表达降低;下调USP8后NCI-N87中p-Akt和p-PI3K的表达降低;而对照组MGC-803细胞中未见显著变化。小结本部分研究发现下调USP8可泛素化降解胃癌细胞内HER-3,进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。全文结论1.USP8基因可靶向调控多个胃癌基因,其中靶基因HER-2和HER-3尤为显著;2.USP8、HER-2和HER-3可作为胃癌预后的独立影响因素;USP8与HER-2和USP8与HER-3两组蛋白在胃癌中的表达均呈正相关,且二者共高表达均与胃癌患者较差预后相关;3.USP8抑制剂可抑制HER-2阳性胃癌细胞的增殖和侵袭;4.下调USP8可泛素化降解胃癌细胞内HER-3,进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。