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大黄鱼(Pseudosciana crocea)是我国特有的经济鱼种,但随着养殖规模的扩大及养殖环境的恶化,病害问题日益严重,已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。因此,开展大黄鱼免疫的分子基础研究,明确重要免疫相关基因的分子特征及功能,不仅可以深化对以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统的认识,也为大黄鱼病害防治提供重要的理论依据。在前期研究中,通过对大黄鱼脾组织cDNA文库的表达序列标签(expressedsequence tag,EST)分析,发现了一个与鱼类及哺乳动物CXCL13型趋化因子有同源性的EST克隆。本研究通过该EST克隆的双向测序获得了大黄鱼CXCL13型趋化因子(LycCXCL13)基因全长cDNA序列,LycCXCL13 cDNA长796个核苷酸,编码由97个氨基酸组成的蛋白,分子量为10.7KD,包含一个24个氨基酸的信号肽和73个氨基酸的成熟肽。成熟的CXCL13蛋白有4个保守的半胱氨酸残基(在第25,27,52和68位),前两个半胱氨酸被一个精氨酸分开。推断的蛋白和其他已知的鱼类CXCL13趋化因子有41%—44%的同源性,和其他脊椎动物有26%—40%的同源性。进化分析显示LycCXCL13和与鱼类CXCL13形成独立一支,和CXCL13亚族的关系最近。我们用大肠杆菌BL21表达系统表达了重组的LycCXC13(rLycCXC13),其对大黄鱼PBLs显示出了明显的趋化活性。组织表达分布研究显示LycCXCL13基因在所检测的7个组织中有表达,包括鳃、心、肌、脾、肝、血和肾,除了肠未检测到表达。经Poly(I:C)和三联灭活细菌疫苗诱导24小时后,LycCXCL13基因在鳃、肝、肾和脾中表达明显上调,在多数组织中三联疫苗刺激引起的CXCL13表达上调比Poly(I:C)要强。荧光定量PCR结果显示:在三联灭活细菌疫苗或Poly(I:C)作为刺激物进行诱导后,CXCL13基因在肾和脾中的表达量都有不同程度的上升。经Poly(I:C)刺激后在脾脏和肾脏中12小时达到最高;经三联灭活细菌疫苗刺激后在肾脏中24小时达到最高,在脾脏中48小时达到最高。以上结果说明LycCXCL13可能在炎症反应有重要作用。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中,由B淋巴细胞产生的一类能与相应抗原特异性结合并激发免疫反应的蛋白,是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的效应分子。本文采用RACE PCR技术克隆了大黄鱼免疫球蛋白M重链(LycIgH)基因全长cDNA,LycIgH长1987个核苷酸,编码一个585个氨基酸的蛋白。它与其他鱼类IgH有着35.0-61.0%的序列一致性。组织表达分布研究显示LycIgH基因在所检测的8个组织中有表达,包括鳃、肠、心、肌、脾、肝、血和肾,属于组成型表达。Poly(I:C)或三联菌苗诱导后,LycIgH基因在肾和脾中的转录产物均有不同程度的上调。在Poly(I:C)诱导下,LycIgH基因转录量在脾和肾中均在诱导后12h达到最高,诱导后在脾和肾中的最高表达量是正常组织的5.87倍和5.48倍,在诱导后24小时恢复到正常水平;三联菌苗诱导下,LycIgH基因转录水平在这两种组织中也出现上调,在脾中在48h达到最高,最高表达量是正常组织的14.53倍;在肾中在12h达到最高,最高表达量是正常组织的3.70倍。大黄鱼LycIgH的表达量在Poly(I:C)或三联疫苗注射48小时之内就显著上升,揭示了鱼类免疫球蛋白可能参与天然免疫反应。进一步模拟了大黄鱼免疫球蛋白重链的空间蛋白结构,与人类IgL的4个domain不同,LycIgH以二个domain的形式存在并实现功能,为进一步研究鱼类IgH结构与功能的关系奠定基础。通过对大黄鱼cDNA文库EST分析,还发现了一个与鱼类及哺乳动物免疫球蛋白轻链有同源性的EST克隆,进一步通过RACE PCR技术获得了10条大黄鱼免疫球蛋白轻链(LycIgL)全长cDNA,根据结构特征将它们分成了三类,即LycIgL1、LycIgL2和LycIgL3。组织表达分布研究显示LycIgL1和LycIgL2基因在所检测的8个组织中有表达,包括鳃、肠、心、肌、脾、肝、血和肾,只有第三类LycIgL在心脏中未检测到表达。荧光定量PCR结果显示:在三联灭活细菌疫苗或Poly(I:C)作为刺激物进行0h,12h,24h,48h,72h诱导后,三类LycIgL基因在肾和脾中的表达量都有不同程度的上升,在不同时段达到峰值,只是LycIgL3在三联菌苗刺激下在脾脏中先有略微的下调又在72h恢复正常并开始上调,推测LycIgL3在脾脏中可能先出现一个不应期,在识别之后即展开免疫应答。大黄鱼三类IgL在细菌或poly(I:C)刺激下的表达上调,说明它们均参与了大黄鱼的免疫应答,并在刺激初期就有效果,且在肾和脾这两种组织中的感染机制也可能有所不同。三类LycIgL在Poly(I:C)或三联菌苗刺激下表达调控模式上的差别表明它们在大黄鱼免疫应答中可能具有不同的作用。同时也模拟了大黄鱼免疫球蛋白三类轻链的空间蛋白结构,显示它们三者没有明显的区别,除了LycIgL3在恒定区缺少了一个α-螺旋。与人类的IgL一致均以二个domain的形式存在并实现功能,为进一步研究鱼类IgL结构与功能的关系奠定基础。