克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种普遍存在于自然环境中的条件致病菌，不但存在于被污染的食品和食品工厂中，还几乎能够从所有的环境中分离得到。感染克罗诺杆菌的高危人群是婴幼儿，死亡率高达20％～50％，幸存下来的婴幼儿也可能导致严重的神经系统后遗症。因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、灵敏、高效、可靠的检测克罗诺杆菌的方法是至关重要的。　　实时荧光单引物等温扩增技术(RF-SPIA)是以单引物等温扩增技术(SPIA)为理论依据，将荧光染料与SPIA技术相结合，利用恒温扩增实时荧光检测系统(DEAOUARTⅡ)，将实时荧光监测仪与电脑相连，通过荧光信号的积累，实时监测反应进程，可自动判定反应结果的阴性与阳性，并生成反应结果图。　　根据克罗诺杆菌在GenBank中16S rRNA基因(HQ880288.1)，利用软件PrimerPremier5.0、DNAMAN设计RF-SPIA引物及Blocker，对反应体系中各添加物条件进行优化，确定25μL的RF-SPIA的反应体系:25 mmol/L MgSO40.8μL，10 mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L引物2.0μL，2×BcaDNA聚合酶缓冲液2.0μL，5×RNaseH缓冲液1.5μL，40 U/μL核糖核酸抑制剂0.6μL，20 mg/mL Bovine Serum Albumin0.9μL，10μmol/L Blocker1.0μL，20 U/μL BcaDNA聚合酶1.0μL，60 U/μL RNaseH0.6μL，模板1.0μL，SYBR GreenⅡ(1∶400)1.0μL，RNase-free Water补足反应体系。RF-SPIA反应程序:扫描频率为60 s一次，反应温度为61℃，反应时间120 min（通过观察反应情况随时停止）。　　本研究以15株克罗诺杆菌和29株非克罗诺杆菌作为试验菌株进行RF-SPIA试验的引物特异性验证，发现阳性结果均为克罗诺杆菌株，其余非克罗诺杆菌菌株结果均显示阴性，由此证明试验所设计的引物特异性高，可用于克罗诺杆菌的检测。本试验对克罗诺杆菌纯培养的灵敏度达到1.4×100 CFU/mL，对克罗诺杆菌基因组的灵敏度达到7.5×101 fg/mL，将克罗诺杆菌人工污染婴幼儿配方奶粉，并测定其检出限达到8.1×102 CFU/g。通过离心沉淀及紫外照射，试验结果可用肉眼直接观察。　　本研究所建立的实时荧光单引物等温扩增技术检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的方法特异性强、灵明度高，方便快捷，还可肉眼观察结果。该检测方法不需要繁琐的电泳过程，操作简单，为快速检测食源性致病菌建立了一个技术平台，更利于基层检验检疫机构的应用。