研究背景及目的狂犬病是世界性流行性疾病,是致命但可预防的人畜共患疾病,可导致严重卫生问题。该病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人兽共患急性传染病,人和温血动物易感,犬是本病毒的敏感宿主和贮存宿主之一,在狂犬病的传播过程中起主要作用。狂犬病主要通过动物咬伤后,唾液中的狂犬病毒经破损皮肤或粘膜侵入体内,在局部组织的神经节繁殖,并进一步侵犯中枢神经系统,最终扩散至外周神经和唾液腺而致病。狂犬病毒在野生动物或圈养动物种群中传播,持续威胁着暴露在患有狂犬病的动物中的人类。狂犬病发生在超过150个国家和地区。亚洲,据估计占全球55000狂犬病死亡病例的56%,每年有31000人死亡,而大多数是儿童。这是一个非常沉重的代价。我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一,狂犬病发病率排名世界第二。预防和接触后治疗需要安全有效的疫苗。接种疫苗预防狂犬病的高危人群、暴露前免疫、暴露后预防性治疗和预防宠物动物被认为是最可行和最重要的方法之一。每年,全世界超过1500万人获得接触后接种疫苗防止狂犬病,这可以每年预防成千上万的狂犬病死亡病例。狂犬病病毒属于弹状病毒科,狂犬病病毒属,形态呈子弹状,长180nm,直径75 nm,其头部为半球形,末端常为平端,病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。其基因组由11928-11932个核苷酸组成,为单链、不分节段的负链RNA,含5个大的开放阅读框,编码5种结构蛋自。基因组从3’端至5’端的排列顺序为N、P、M、G和L基因,分别编码病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)、磷蛋白(phosphoprotein, NS)、膜基质蛋白(matrix protein,MP)、糖蛋白(glycoprotein, GP)和转录大蛋白(polymerase, LP)。糖蛋白是狂犬病毒中唯一能刺激机体产生中和抗体的抗原,其抗原性的保持主要依赖于其空间构象。狂犬病毒糖蛋白的结构特点与其抗原性和免疫原性密切相关,它在刺激机体产生免疫应答的过程中发挥重要作用。糖蛋白是狂犬病毒的主要保护性抗原。具有B、T细胞识别位点,能够诱导机体发生细胞和体液免疫应答,刺激机体分泌中和抗体。糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要质量指标,在狂犬病疫苗的研制过程中常需要及时进行抗原含量的检测,目前用于狂犬病毒疫苗效力评价的经典实验是美国国立卫生研究院(NIH)的方法。多年来我国也一直采用NIH法来测定。狂犬病疫苗使用NIH动物法测定存在成本昂贵、检测周期长、繁琐和涉及到使用活狂犬病毒的安全问题,以及受到国际动物保护协会对实验动物使用的制约,因此不适用于疫苗生产过程中各步骤的监测。因为狂犬病病毒糖蛋白的含量表明疫苗的效力,在单克隆抗体可以正确识别折叠糖蛋白的条件下,可以采用免疫检测方法定量糖蛋白含量,进而判定疫苗效价。已经有不少基于使用特定单克隆抗体对狂犬病病毒糖蛋白进行测定的研究报道：IFA法、EIA、双抗体夹心ELISA法等。因此,寻求更可靠、精确和快速的体外定量检测狂犬病毒疫苗糖蛋白含量的检测方法来替代NIH法势在必行。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染的是诱发急性和慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的主要原因之一。乙肝表面抗原(Hpatitis B surface antigen, HBsAg)是第一个可以在丝状或球形表面抗原颗粒并在复制的循环过程中被检测的病毒标志物。检测乙肝表面抗原量约为完整的病毒颗粒数量的1000倍。乙肝表面抗原可用测定技术在临床肝炎发展出现6到8周后检测到。此外,乙肝表面抗原在患者血清的数量远超过乙型肝炎病毒完整病毒粒子,并有强烈的免疫原性。HBsAg的检测是在大多数其他血清学标志物可能无法检测的情况下评估急性或慢性乙型肝炎病毒感染最重要的方法。HBsAg检测的另一个重要用途是筛查献血者的血液制品来排除乙肝病毒感染。肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)被认为是第五个最常见的癌症和第三世界广泛的癌症相关死亡最常见的原因。由于全球大流行的乙肝和丙肝病毒感染,肝癌的发病率在亚洲和西方国家迅速增加,这一趋势将持续未来50年由于长期感染之间的延迟和肝细胞癌的发展。更重要的是,一些早期的肝癌患者往往无临床症状,这往往导致诊断的延误和高死亡率。肝癌的主要标志物是甲胎蛋白,是单一多肽链糖蛋白,它是特定的肝癌标志物并广泛用于肝细胞癌的诊断。使用甲胎蛋白对肝癌的早期检测是非常可取和重要的。现在,甲胎蛋白已经被用于筛查肝癌在高风险但无临床症状的患者,特别是早期可以治愈的肿瘤,可以减少疾病相关死亡率和改善生存和成本效益,这些优势使甲胎蛋白具有非常重要的临床意义。但由于晚期的肝细胞癌的预后仍然很悲观,因此新的治疗方案和诊断策略的开发迫在眉睫。目前已经有不少有关于甲胎蛋白和乙肝表面抗原免疫测定方法的报道。然而,所有这些都是检测一个分析物而不是检测拥有彼此互相关联多个生物标志物。甲胎蛋白和乙肝表面抗原如果可以在相同的单一分析进行测定,整个过程将变得简单,并缩短了检测时间。同时检测甲胎蛋白和乙肝表面抗原可以获得更多相关数据,帮助临床医生监控从慢性乙型肝炎到肝癌的整个转换过程和肝细胞癌的预后评估。双标记已经在各领域有潜在的应用。然而,传统的荧光标记在多个分析物测定上有很大的局限性,就是很难区别各个标志物的发射光区域。因此临床上也迫切需求开发一个快速、适合和简便的甲胎蛋白和乙肝表面抗原双标记免疫分析技术。标记免疫学,就是将标记技术和免疫学技术相结合进行分析测定的一门学科,是集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科,其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性和各标记物的高灵敏可测量性来检查各种生物活性物质的活性和浓度。随着标记技术、单克隆抗体技术和分子生物学技术的不断发展与完善,标记免疫学已广泛应用于医学、农业、环境及食品检测等多个领域。目前该方法包括一系列的免疫分析技术：荧光免疫分析(Fluoroimmunoassay,FIA)、放射免疫分析(Radioimmunoassay, RIA)、酶免疫分析(Enzymatic immunoassay, EIA)、胶体金免疫分析(Gold immunochromatographic assay, GICA)、时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)等。时间分辨荧光免疫分析是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子具有独特的荧光特性,该技术能够获得极高的信噪比,从而具有很高的灵敏度(10-18mol/孔),且具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、标准曲线范围宽、操作流程短、易自动化、不受样品自然荧光干扰、多标记和应用范围十分广泛等优点。因此,时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析以及胶体金分析法有更高的临床应用价值。TRFIA技术适用于各种抗原抗体的临床检测,在市场上已得到广泛应用。本研究采用时间分辨荧光免疫分析技术研制狂犬病毒糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原的双标记定量检测试剂,评价各项性能指标,并与其它检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。方法：采用双抗体夹心法研制狂犬疫苗糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原双标记时间分辨荧光免疫分析试剂。一、人用狂犬疫苗糖蛋白定量检测试剂的研制与应用1.狂犬病毒糖蛋白抗原的制备：根据狂犬病毒CTN株G基因膜外序列设计引物,提取狂犬病毒CTN株总RNA,采用AMV酶逆转录获得cDNA,利用PCR的方法从cDNA中扩增G基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体p ET32a(+)中,构建原核表达载体p ET32a/G。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达G基因的最佳诱导时间。SDS-PAGE和Western-blo讨表达产物进行检测和分析。2.人用狂犬病毒抗糖蛋白单克隆抗体的制备：以狂犬疫苗制剂为抗原免疫Bal/C小鼠,效价达到1：64000后,采用杂交瘤融合的方法制备单克隆抗体,使用狂犬病毒原液、人血清白蛋白及狂犬病毒核蛋白进行筛选对抗体进行初步筛选,筛出48株疑似糖蛋白单抗。3.单克隆抗体的纯化：用Protein G Sepharose 4 Fast flow亲和层析柱纯化,并用BCA试剂盒测抗体浓度。4.铕标记抗体与纯化：超滤管纯化抗体后,按质量比5：1与铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1m1/管),收集液逐管取样测量荧光信号值,合并信号峰值的收集管,加10%BSA保护剂,—20℃保存。5.特异性糖蛋白抗体的筛选及配对：先用狂犬病毒原液作为双抗夹心的标准品,将48株抗糖蛋白单抗逐一包被,与另外47株铕标抗体配对,绘制标准曲线,筛出配较佳的配对组合,再用自制糖蛋白抗原和企业标准品作为标准品,从中绘制标准曲线,最终筛出配对得上的单抗。6.参考标准品的配备用标准品缓冲液将糖蛋白抗原配制成0、31.25、62.5、125、250和250 mEu/L系列参考标准溶液,每瓶1 m1分装冻干4℃保存备用。7.试剂性能指标的评价7.1标准曲线的绘制：以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理,绘图软件为OriginPro7.5 SR1 (Microcal, USA)。7.2灵敏度实验：将零值参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为分析灵敏度。7.3 Hook效应：对浓度递增的多个参考标准品抗原进行测定。7.4准确度实验：以自制参考品为对照品,并以自制参考品的实测浓度与标示浓度的比值在0.90-1.10之间作为评价准确性合格的标准。7.5精密度实验：采用低、中、高3个质控品(质控品I、II、III)进行测定,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV)。7.6稀释线性实验：已知的3个浓度的样品使用标准缓冲液连续稀释进行平行度分析。7.7交叉反应：通过检测狂犬疫苗核蛋白来测定自制试剂的交叉反应情况。7.8与NIH法测值的比较实验：样本用自制试剂与NIH法所测浓度值进行相关性分析。二、采用双抗体夹心法研制乙肝表面抗原与甲胎蛋白双标记时间分辨荧光免疫定量检测分析试剂。1.用标准品稀释液将AFP抗原配制成系列浓度为：0 mIU/L、2 mIU/L 20 mIU/L、200 mIU/L、1000 mIU/L和2000 mIU/L;同时用标准品稀释液将HBsAg抗原配制成系列浓度为：0μg/L、0.4 μg/L、2 μg/L、10μg/L、50 μg/L和300 μg/L;再将两种母液分别从低浓度到高浓度按1：1混匀,最后AFP (mIU/L)/HBsAg(μg/L)标准品浓度为：0/0、1/0.2、10/1、100/5、500/25和1000/150；每瓶1ml分装冻干,4℃保存备用。2.固相包被抗体用包被液将AFP和HBsAg包被抗体稀释后,一同加入96微孔板中包被,37℃震荡2小时后,4℃过夜,37℃封闭3小时,真空抽干,4℃保存。3.Eu3+标记抗体制备超滤管纯化抗体后,按质量比5：1与铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1ml/管),逐管测量荧光信号值,合并峰管,加10%BSA保护剂,-20℃保存。4.Sm3+标记抗体制备超滤管纯化抗体后,按质量比2：1与钐标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1ml/管),然后逐管测定荧光信号值,合并峰管,加入10%浓度的BSA作保护剂,—20℃保存。5.试剂性能指标的评价5.1标准曲线的绘制以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理,绘图软件采用OriginPro7.5 SRI (Microcal, USA)。5.2灵敏度实验以零参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍的标准差所得信号值再减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。5.3准确度实验以自制参考品为对照品,计算试剂参考标准品的实测浓度与标示浓度的比值。5.4精密度实验精密度实验采用自制的低、中、高3个质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)进行测定,分析内精密度实验设置复孔,分析间精密度实验设多次测定,计算各质控品检测值的均数、标准差及CV值。5.5稀释线性实验使用标准缓冲液将已知浓度的血清样本从1/2至1/32连续倍比稀释进行平行度分析。5.6干扰实验检测本实验研发的分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。按试剂操作说明书对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,计算其回收率。5.7与国外试剂的比较实验同时采用自制试剂及雅培化学发光两种试剂盒检测血清样本,使用统计软件分析测值相关性。结果：一、成功从狂犬CTN株获取目的基因,并构建p ET32a/G重组质粒,重组蛋白在BL21 (DE3)宿主菌中以包涵体的形式表达,通过包涵体洗涤、Ni离子亲和层析以及透析复性后抗体鉴定得到了纯度较高的有活性的狂犬病毒糖蛋白抗原。采用单克隆抗体制备的经典方案,以狂犬疫苗制剂免疫小鼠,取脾进行细胞融合成功制备出48株疑似狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体细胞株,进一步采用糖蛋白抗原筛选出符合使用要求的特异性糖蛋白单克隆抗体配对组合(S036-S053EU3+)。并以特异性糖蛋白单克隆抗体配对组合(S036-S053EU3+)为基础成功研制出狂犬疫苗糖蛋白时间分辨荧光免疫分析试剂,自制试剂参考品实测浓度与标示浓度的比值在0.90-1.10之间；灵敏度为0.098mEU/mL,在样品浓度超过2000 mEU/mL将出现HOOK效应；试剂分析内变异系数和分析间变异系数均不超过10%；与狂犬核蛋白无交叉反应；189份狂犬病毒样品采用自制试剂和武汉病毒研究所糖蛋白ELISA检测试剂盒武汉进行平行检测,对所测数值进行相关性分析,结果显示两种方法所得的数值相关性良好：Y=1.00X+1.38, R2=0.912, P<0.0001；通过效力实验所得数据做出糖蛋白浓度与参考疫苗和各样品疫苗的线性关系,并计算出TRFIA所测得的疫苗效力值(T-NIH)。同时对TRFIA和NIH动物法所测得的39份疫苗效力值进行趋势和相关性分析,结果两种方法所得的数值趋势一致,相关性良好：Y=0.930X+0.114, R2=0.903, P<0.0001,两种方法所测的数值进行配对t检验,结果显示：t0.05/2,38=-1.223, P=0.229>0.05,表明两种方法所测的数值差异无统计学意义。二、自制乙肝表面抗原与甲胎蛋白双标记时间分辨荧光免疫免疫分析试剂在检测AFP和HBsAg的分析灵敏度分别为0.09 mIU/L和0.01 μg/L。检测范围分别为1-1000mIU/L和0.2-150 μg/L,在检测AFP时分析内和分析间变异系数分别为3.3-4.1%和5.7-7.2%,而在检测HBsAg时分析内和分析间变异系数分别为2.9-3.9%和4.9-6.8%。自制试剂临床血清样本测值同化学发光法测值相关性良好(R2AFP=0.989,P<0.0001；R2HBsAg=0.988,P<0.0001),两种方法所测的数值进行配对t检验,结果显示：tAFP 0.05/2,111=-0.846,P=0.399>0.05;tHBsAg 0.05/2,82=0.557,P=0.579>0.05,可以认为两种方法所测数值的差异无统计学意义。结论：上述结果表明本研究研制的狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原与甲胎蛋白双标记时间分辨荧光免疫分析试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密度和抗干扰性等)均达到检测试剂的使用要求,狂犬疫苗糖蛋白时间分辨荧光免疫分析试剂疫苗样品测值与NIH法测值有良好相关性,有望替代NIH动物测定法用于疫苗生产的监控及其有效性的鉴定。乙肝表面抗原与甲胎蛋白双标记时间分辨荧光免疫分析试剂有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研究。